杜仲皮水提液对大鼠成骨细胞BMP2基因表达的影响

2022-04-29邢晓旭冯学慧

饲料博览 2022年2期

邢晓旭，冯学慧

（1.太原动物园，太原 030009；2.大同市动物疫病预防控制中心，山西大同 037000）

随着社会文明的进步，动物福利不断受到人们关注，尤其是一些伴侣动物，它们的老年生活质量也越来越受人们重视。跟人类一样，骨质疏松等骨科疾病也困扰着它们。近年来的研究发现西药在治疗骨科疾病方面存在不良作用大、远期疗效不肯定、价格昂贵等缺点，因此中药的应用进入到了人们的视野。

根据中医“肾主骨生髓”的理论，临床上多采用复方或是单味补肾中药治疗骨质疏松等骨科疾病，效果良好但机理尚不清楚[1]。

中药杜仲为杜仲科植物杜仲的树皮[2]，能够补肝肾强筋骨，甘微辛，温，入肝肾经。本研究旨在通过探讨常用补肾中药杜仲水提液对大鼠成骨细胞BMP2基因表达的影响，来揭示杜仲在防治骨质疏松症等骨科疾病方面的机理，为临床用药提供理论基础。

1 材料

1.1 试验动物

出生24 h 内的SD 大鼠乳鼠，是由购自凯学生物科技公司的SD大鼠自行繁殖获得。

1.2 试验药物

中药杜仲是植物杜仲的树皮，购于同仁堂药店。

1.3 试验试剂

DMEM 完全培养基、胶原酶，Gibco 公司产品；反转录试剂盒、胶回收试剂盒，TransGen Biotech公司产品；PCR引物、BMP2引物，生工生物工程（上海）有限公司产品；荧光定量PCR 仪，Applied Biosystems公司生产。

2 方法

2.1 大鼠成骨细胞的培养

取出生24 h 内的大鼠10 只，用医用乙醇浸泡消毒后，在无菌超净台内用高压灭菌的外科手术器分离出颅骨，经2次酶消化后，加入完全培养基终止消化，离心后用完全培养基制成细胞混悬液铺于细胞板内。放置于二氧化碳培养箱中培养，隔天换液。

2.2 大鼠成骨细胞的鉴定

培养的细胞采用瑞氏染色、茜素红钙化染色进行鉴定[3]。

2.3 杜仲皮水提液的制备

将中药杜仲100 g与纯化水按1∶10混合后浸泡1 h。煮沸后文火煎30 min，过滤药液。重复煎煮1次，将2次过滤药液合并，离心后取上清液，旋转蒸发浓缩成浓度为1 g·mL-1的溶液。调pH值至7.2～7.4，然后用0.22 μm的微孔滤膜过滤，用DMEM维持培养液（含4%标准胎牛血清）稀释配制成含药量分别为3×10-1mg·mL-1、3×10-2mg·mL-1、3×10-3mg·mL-1、3×10-4mg·mL-1和3×10-5mg·mL-1作为试验组，以不加药的DMEM维持培养液作为对照组。

2.4 总RNA的提取及cDNA的合成

取第2代成骨细胞，分别加入含不同浓度药液的培养基培养24 h、48 h和72 h后收集细胞。

用Trizol法提取成骨细胞的总RNA并进行反转录。BMP2和β-actin 的基因序列参考相关报道[4]。见表1。

表1 成骨细胞BMP2和β-actin引物序列

2.5 制备荧光PCR标准曲线及目的基因检测

将目的基因纯化回收后与克隆载体连接。将经过鉴定的阳性菌测序后分别提取出β-actin和BMP2的质粒。将标准质粒按倍数稀释后制备标准曲线。最终将各个浓度的cDNA进行实时荧光PCR基因检测，通过标准曲线算出相对拷贝数。

3 结果与分析

3.1 大鼠成骨细胞的鉴定

培养细胞经瑞氏染色后可见呈典型成骨细胞形态。经茜素红染色后有明显矿化结节，符合成骨细胞特点。可确定培养的细胞是大鼠成骨细胞（见图1）。

3.2 目的基因的鉴定

重组质粒测序后，通过对阳性菌液的测序，得到BMP2 和β-actin 扩增产物的核苷酸序列，在GenBank 上进行BLAST-N 分析，发现β-actin 与已知大鼠的mRNA 序列的部分核苷酸同源性为100%；BMP2与已知大鼠的mRNA序列的部分核苷酸同源性为99%（见图2 和图3）。证明所制备的质粒含有目的基因，序列可靠，纯度良好。

3.3 杜仲皮水提液对大鼠BMP2表达的影响

不同浓度杜仲皮水提液对大鼠成骨细胞BMP2基因表达的影响见图4。由图4 可知，大鼠成骨细胞BMP2 基因表达量与杜仲皮水提液的浓度成正比，而与作用的时间成反比。其中3×10-1mg·mL-1组的BMP2的表达量与对照组相比有极显著差异，3×10-2mg·mL-1组在作用24 h 时与对照组相比差异极显著。相同浓度药物作用时，作用24 h时的BMP2的基因表达量增多，尤其是3×10-1mg·mL-1、3×10-2mg·mL-1作用48 h和72 h后与24 h相比有显著差异。

图4 不同浓度杜仲皮水提液在不同时间对BMP2/β-actin值的影响

4 讨论

机体内骨组织在不停地进行旧骨的吸收和新骨的形成[5]。在这个过程中成骨细胞扮演了重要的角色，在骨形成的过程中分泌骨基质，骨基质经过矿化后形成新骨[6]。BMP2 是骨形态发生蛋白家族中的一员[7]，能够诱导骨组织形成骨组织局部生长因子，是骨修复中最重要的诱导因子[8]。有研究表明局部注射补充BMP2可在短期内预防骨折，BMP2基因的表达与老年性骨质疏松有密切的关系[9-10]。

β-actin 作为内参是管家基因的一种，它在不同的组织细胞中表达量基本一致。因此最终结果采用BMP2 与β-actin 的比值来表示，即采用的是BMP2基因表达的相对浓度来进行相互比较，可以减少试验过程中的误差，增加试验的准确率。

本试验采用实时荧光定量PCR 法，通过检测不同浓度杜仲皮水提液对大鼠成骨细胞BMP2 基因与β-actin 比值的影响，来研究其对大鼠成骨细胞BMP2 基因表达的影响。从试验结果可以看出，与对照组相比，较高浓度（3×10-1mg·mL-1）的杜仲皮水提液能显著地提高大鼠BMP2基因的表达，尤其作用24 h，对BMP2基因的表达具有很强的促进作用。