李月娇 孙淑琴 霍建飞 马浩轩 史硕 杨秀荣 李亮

摘要：为了解天津小麦茎基腐病的发生情况，本试验分别在天津市蓟州区、宝坻区、武清区、静海区和北辰区5个小麦主栽区采集茎基腐病害样品33份，分离真菌菌株204个。经致病性测定、形态学观察及对rDNAITS的分子检测，最终确定为5类病原菌，分别为小麦根腐离蠕孢（Bipolarissorkiniana）、假禾谷镰刀菌（紫红色、黄色，Fusariumpseudograminearum）、燕麦镰刀菌（F.avenaceum）和木贼镰刀菌（F.equiseti），优势菌株为假禾谷镰刀菌，占分离病原菌总数的74.5%。5类病原菌对8种杀菌剂的敏感性测定结果表明，咯菌腈、丙硫菌唑和咪鲜胺对蠕孢菌的抑制效果最好，咯菌腈、咪鲜胺和多菌灵对镰刀菌的抑制效果最好。

关键词：小麦茎基腐病;分离与鉴定;杀菌剂;敏感性测定

小麦是我国三大主要粮食作物之一，年产量约占主要粮食作物总产量的20%[1]。近年來，由于气候变暖、秸秆还田导致的土壤中病原菌的积累，以及耕作制度演变等诸多因素的影响，小麦茎基腐病（wheatcrownrot）的发生与危害不断加重和蔓延[2，3]。小麦茎基腐病可造成小麦减产约35%，严重时导致部分田块绝收，威胁小麦的生产[4-6]。

小麦茎基腐病是一种由多种病原菌复合侵染引起的土传性真菌病害，在小麦的各个生育期均可发生[2，7-9]。在中国，由陈厚德于1996年首次报道该病害在江苏省发生，随后河南、河北、山东、安徽和陕西等小麦主产区也报道小麦茎基腐病的发生，对我国小麦种植业造成极大影响[8，10-14]。小麦茎基腐病至少可由16种以上的镰刀菌侵染引起，已报道致病菌有禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）、假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum）、木贼镰刀菌（F.equiseti）、三线镰刀菌（F.tricinctum）和层出镰刀菌（F.proliferatum）。其中假禾谷镰刀菌在中国黄淮和西北地区被报道为引起小麦茎基腐病的优势菌株，其田间发病率可达70%[8，9，15-17]。此外，小麦根腐离蠕孢（Bipolarissorkiniana）也是导致小麦茎基部变褐的主要病原菌之一[18]。

天津市小麦年栽培面积在10～12万公顷之间，主要集中在武清区、宝坻区、静海区、蓟州区和北辰区。据调查，近年来天津市小麦茎基腐病发生普遍，严重地块引起死苗、死蘖，减产30%以上。为了明确天津地区小麦茎基腐病的病原菌组成及优势菌株，本试验开展了病原菌的分离、致病力测定、rDNA-ITS的分子鉴定等研究，结合形态特征，鉴定得到5类病原菌，优势菌株为假禾谷镰刀菌。此外，小麦茎基腐病在小麦各个生育期均可发病，目前尚未选育出能有效抵抗该病害的小麦品种，当前对该病害仍以化学药剂防控为主[15，19-21]。因此本试验采用菌丝生长速率法测定了5类病原真菌对8种杀菌剂的敏感性，以期为小麦茎基腐病的高效防治提供参考。

1材料与方法

1.1小麦茎基腐病害样品采集

自天津市蓟州区、宝坻区、静海区、武清区、北辰区5个小麦种植区共采集33份小麦茎基腐病病害样品。

1.2病原菌的分离

采用组织分离法[22]：首先用无菌水将小麦病株根茎部冲洗干净，吸干水分后将病健交界处组织剪成长宽约为4mm的小块，采用5%次氯酸钠溶液对病块组织表面消毒3min，随后用无菌水漂洗，置于灭菌滤纸上晾干后转移至PSA平板，于25℃培养箱中培养72h。

1.3致病力测定

以小麦“津农6号”为测试材料，剪下植株同一部位叶片，用75%乙醇进行表面消毒，并将叶片分成两组，一组用灭菌牙签刺穿叶片后将5mm菌饼贴于伤口处，另一组直接将菌饼紧贴于小麦叶片上，每组重复3次，每重复3片叶，将其放置于25℃、湿度100%的人工气候箱内培养48h后调查发病情况。

1.4病原菌分子鉴定

将分离菌株在PSA平板培养3d后，刮取少量菌丝，采用擎科生物科技有限公司生产的2×T5DirectPCRKit进行PCR扩增。采用通用引物ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′（上海生工生物工程技术服务有限公司合成）扩增目标片段[23]，扩增体系：模板DNA2μL，引物（10μmol/L）各2μL，2×T5DirectPCRMix25μL，ddH2O补足至50μL。扩增程序：98℃预变性3min;98℃变性10s，61℃退火10s，72℃延伸30s，共35个循环;72℃延伸5min，4℃保存。随后将PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，并将电泳后有明显单一条带的PCR产物送至擎科生物科技有限公司进行测序，测序结果在NCBI基因库进行BLAST比对，确定病原菌种类。采用软件MEGA5.05进行ClustalW比对，以邻近相接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树[24]。

1.5化学药剂

针对镰刀菌及蠕孢菌两大类病原菌，选择目前农业生产上常用的8种化学药剂：97.2%戊唑醇原药（天津市华宇农药有限公司）、96.0%苯醚甲环唑原药（一帆生物科技集团有限公司）、97.0%咪鲜胺原药（武汉能仁医药化工有限公司）、98.0%恶霉灵原药（天津市绿亨化工有限公司）、97.0%多菌灵原药（湖北万业医药有限公司）、95.0%福美双原药（河北冠龙农化有限公司）、97.0%丙硫菌唑原药（天津市华宇农药有限公司）、95.0%咯菌腈原药（瑞士先正达作物保护有限公司）。

1.6毒力测定

采用菌丝生长速率法测定。分别准确称取以上化学药剂原药，每种原药加入1mL丙酮和10μL吐温80溶解，加入无菌水配成母液。将计算好的一定量（根据预试验得出的抑菌率为10%～80%时的药剂浓度范围）的药剂加入50℃左右的PSA培养基中，充分振荡混匀后，倾入直径为9cm的灭菌培养皿中，每个浓度重复3～4次，以加无菌水的平板为空白对照。用接种针将待测菌株的菌饼分别移入不同浓度的含药培养基平板上，正面向下（每皿一饼），置于25℃恒温培养箱中培养72h后调查菌落直径。以药剂浓度的对数值为X，抑菌率的机率值为Y，求出药剂的毒力回归方程Y=a+bX和相关系数，并计算有效中浓度EC50值。

2结果与分析

2.1小麦茎基腐病田间症状

于2021年4月25日小麦分蘖期和6月9日小麦灌浆期自天津市蓟州区、宝坻区、静海区、武清区、北辰区5个小麦种植区，共采集小麦茎基腐病害样品33份。病株症状如图1所示，苗期症状：叶片变黄，植株茎基部1～2节变褐;成熟期症状：白穗，茎节或根部变褐，早衰死亡。

2.2小麦茎基腐病病原菌分离结果

33份小麦茎基腐病害样本中共分离到204株病原真菌。根据菌落颜色、生长速度和孢子形态等指标将204株病原菌归类为A、B、C、D、E五类菌群。如表1所示，B类菌株的检出率最高，共分离出102株，分离频率为50.0%;C类和A类菌株次之，分别得到50株和44株，分离频率分别为24.5%和21.6%;D类和E类菌株的检出率较低，分别分离到6株和2株，占分离病原菌总数的2.9%和1.0%。A类菌株主要分布在北辰区，极少数来源于蓟州区和宝坻区;B类菌株在天津市5个区均有分布;C类菌株除北辰区和静海区外，其余3个区均有分布;D类菌株在蓟州区、宝坻区和北辰区有分布;E类菌株仅在宝坻区分离到。以上结果表明引起天津小麦茎基腐病的优势致病菌为B类菌株，且该菌株在5个区均有分布。

2.3病原菌形态学鉴定

A类菌株：在PSA平板上产生白色气生菌丝，较繁茂，菌落颜色随培养天数的增加逐渐加深，直至呈灰绿色或黑绿色。分生孢子长椭圆形或长梭形，直或弯曲，黑褐色，有分隔，以5～7隔居多。初步鉴定，该菌株为小麦根腐离蠕孢（Bipolarissorokiniana），属半知菌亚门离蠕孢属真菌（图2A）。

B类菌株：在PSA平板上产生大量白色絮状气生菌丝，菌落背面成紫红色，随培养天数的增加颜色逐渐加深。大型分生孢子呈镰刀形，顶胞较尖呈鸟嘴状，3～7个隔膜，3个隔膜居多，分隔明显（图2B）。

C类菌株：在PSA平板上产生大量白色絮状气生菌丝，菌落背面成黄色，随培养天数的增加颜色逐渐加深。大型分生孢子呈镰刀形，顶胞较尖呈鸟嘴状，3～7个隔膜，3个隔膜居多，分隔明显（图2C）。

D类菌株：在PSA平板上产生短羊毛状气生菌丝，菌落呈紫红色，后期菌落正面长有少部分黄色菌丝并呈环状分布，背面呈深紫红色。大型分生孢子细长且直，呈线形，1～3个隔膜（图2D）

E类菌株：在PSA平板上产生致密平坦的絮状气生菌丝，菌落初期为白色至粉色，后逐渐变为土黄色。大型分生孢子呈镰刀状，细长弯曲，顶细胞细长且基细胞足跟比较明显，3～7个隔膜（图2E）。

2.4致病力测定

病原菌对小麦叶片的侵染结果如图3所示，5种真菌对小麦叶片均具有致病力。病原菌A在有伤口的情况下可快速侵染小麦叶片组织并蔓延，而在没有伤口时，未见有明显侵染，表明伤口对其侵染起重要作用;病原菌B、C、D和E有无伤口对其侵染无明显影响，湿度较大时均能成功侵染并蔓延生长，尤其是B和C菌株生长速度极快，引起小麦叶片组织的黄化和腐烂;菌株D的致病性较弱（图3）。

将接种发病的小麦组织表面消毒后，重新在PSA平板上进行病原菌分离，均分离到对应的接种病原菌，表明分离到的5种真菌均为致病菌。

2.5病原菌分子生物学鉴定与系统发育分析

基于形态学观察结果，初步鉴定菌株B、C、D和E属于镰刀菌属。为进一步明确上述4种病原菌，对菌株B～E的rDNA-ITS序列进行PCR扩增，凝胶电泳结果（图4）显示，4株菌的PCR产物在500～750bp之间均有一条明亮且单一的条带，测序结果显示菌株B～E扩增片段大小分别为581、586、610、597bp。将测序结果与NCBI基因库中已发表的镰刀菌rDNA-ITS序列进行比对，菌株B和C的rDNA-ITS序列与已报道的假禾谷镰刀菌（F.pseudograminearum，ID：MH333075）序列高度相似，相似性分别为99.28%和99.10%;菌株D为燕麦镰刀菌（F.avenaceum，ID：KT963799），其rDNAITS序列与已报到的序列相似性为99.32%;菌株E为木贼镰刀菌（F.equiseti，ID：MH054915），其序列相似性达99.47%。

由系统发育树（图5）可知，4株致病菌聚为两个大的分支，MH681156等13个序列与菌株B、C和E的序列聚在一起，KT963799等9个序列与菌株D的序列聚为另一个分支。菌株B和C与假禾谷镰刀菌的序列以98%的支持率聚在一起，菌株D与燕麦镰刀菌以97%的支持率汇聚为一个子分支，菌株E与木贼镰刀菌以99%的支持率汇聚为一个子分支。

2.6化学药剂的毒力测定

由表2可知，针对小麦根腐离蠕孢菌，多菌灵和恶霉灵的EC50值最高，分别为97.2477mg/L和77.7393mg/L，表明离蠕孢菌对上述两种杀菌剂不敏感，单独使用这两种药剂不能有效防控小麦茎基腐病;其他6种药剂对离蠕孢菌的抑制活性较高，EC50值为0.0704～16.9555mg/L，其中咯菌腈、丙硫菌唑和咪鲜胺的抑制效果最好，福美双的抑制效果较弱。供试杀菌剂对离蠕孢菌的杀菌活性顺序为咯菌腈>丙硫菌唑>咪鲜胺>戊唑醇>苯醚甲环唑>福美双>恶霉灵>多菌灵。咯菌腈、丙硫菌唑、咪鲜胺、戊唑醇可作为对由离蠕孢菌引起的小麦茎基腐病化学防治的候选杀菌剂。

8种杀菌剂对4种镰刀菌的毒力测定结果如表3所示，8种药剂在一定浓度下对4种镰刀菌均表现出抑制作用，且随浓度的增加，抑制效果更为明显。不同药剂对镰刀菌的EC50值不同，其中咯菌腈和咪鲜胺的EC50值最小，多菌灵次之;咯菌腈的EC50值分布在0.0704～0.8678mg/L之间，咪鲜胺的EC50值在0.0627～7.9713mg/L之间，多菌灵的EC50值在0.2732～14.1241mg/L之间，表明上述3种杀菌剂对4种镰刀菌均具有极强的抑制活性。其他5种杀菌剂对镰刀菌的抑菌活性相对较弱。上述8种杀菌剂均可作为对由镰刀菌引起的小麦茎基腐病化学防治的候选杀菌剂，其中咯菌腈、咪鲜胺和多菌灵的防治效果最佳。

3讨论与结论

近年来，小麦茎基腐病在中国小麦各主产区频繁发生，严重威胁小麦生产。本研究从采自天津5个主要小麦种植区的33份小麦样品中共分离到真菌菌株204个，分为5个菌群，通过形态学鉴定和基于rDNA-ITS的分子鉴定，确定为小麦根腐离蠕孢菌、假禾谷镰刀菌（紫红色、黄色）、燕麦镰刀菌和木贼镰刀菌。其中假禾谷镰刀菌检出率达74.5%，在天津5个区均有分布;离蠕孢菌的分布次之，检出率为21.6%，绝大部分来源于北辰区。不同地区病原菌的种类存在差异，引起天津地区小麦茎基腐病的优势病原菌为假禾谷镰刀菌，其次为小麦根腐离蠕孢。

明确病原菌的组成及致病性的差异，对制定防治策略和指导抗病育种具有重要意义。本试验结果表明，假禾谷镰刀菌比小麦根腐离蠕孢的致病力更强，离蠕孢菌仅在有伤口时快速侵染小麦组织并蔓延，而在没有伤口时未发生侵染，表明伤口是其侵染所必须的。相反，有无伤口对镰刀菌菌株的致病性没有影响，只要湿度充足，病原菌都能侵染小麦组织并蔓延生长，尤其是假禾谷镰刀菌生长速度极快，引起小麦组织的黄化和腐烂。

在采样的过程中发现当小麦长势弱或受到伤害（除草剂、缺素症等）时会加重病害的发生。此外，已发病的田块当浇水不当导致土壤湿度过高，或者因地块不平出现的低洼区域发病情况较重。但是，当小麦种子进行包衣处理后，发病程度较不进行种子包衣的田块减轻[25-27]。因此，建议小麦在播种前进行种子處理，且优先选用咯菌腈和咪鲜胺，并根据当地病原菌组成搭配使用多菌灵和丙硫菌唑，避免抗药性的产生。