钱晨曦，董 杰，雷 晖，陈书强，芦 洁，金 妮，王晓红

(空军军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心，陕西 西安 710032)

卵母细胞体外成熟(in vitro maturation，IVM)是辅助生殖技术之一，即在没有或很少外源性促性腺激素刺激后，从卵巢组织中收集较小的未成熟卵母细胞，在体外培养体系中培养至成熟的过程[1]。与传统体外受精联合胚胎移植技术(in vitro fertilization，IVF)相比，IVM具有诸多优势，如降低辅助生殖治疗的成本，且可不需要IVF过程中的超促排卵治疗，避免了高雌激素的风险，可有效预防卵巢过度刺激综合征的发生[2]；此外，IVM可以充分利用活体取卵中获得的未成熟卵母细胞，减少卵母细胞的浪费，扩展了安全的供卵途径，在多囊卵巢综合征不孕患者的临床治疗和女性生育力保存方面具有广泛的应用和重要的价值。虽然IVM与传统IVF相比有诸多优势，但目前全球IVM的临床妊娠率(25%～30%)仍显著低于传统IVF(45%～50%)。从1965年Edwords团队首次利用体外培养技术使卵母细胞发育成熟以来，临床上应用的IVM培养液虽然略有不相同，但主要促成熟因子都是促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)或表皮生长因子[2,3]，该体系最大的问题是卵母细胞核质成熟不同步，从而影响后续胚胎发育潜能，导致临床妊娠率较低[4]。因此，探索更合适IVM培养液中的促成熟因子、优化IVM培养体系对IVM的推广应用和发展尤为重要。

Kisspeptin(KISS1)是由KISS1基因编码的多肽，在体内被水解为不同大小的片段发挥作用，根据其片段大小命名为KP10、KP13、KP54(啮齿动物中为KP52)，这些多肽片段通过与其受体(kisspeptin receptor，KISS1R)结合后发挥功能。一方面，中枢神经系统-下丘脑的前腹侧室周核和弓状核存在合成和分泌kisspeptin蛋白的kisspeptin神经元[5]，其分泌的kisspeptin蛋白可以与促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)神经元上的KISS1R结合，调节GnRH的分泌，从而发挥对下丘脑-垂体-性腺轴的调节作用[6]。另一方面，在外周组织尤其是生殖发育相关组织，如睾丸、卵巢、子宫、胎盘等组织中广泛表达KISS1基因及其受体KISS1R[7,8]。Kisspeptin可通过直接作用调节外周生殖器官或组织功能，尤其是在卵巢组织中，颗粒细胞分泌的kisspeptin蛋白通过与其自身和卵母细胞上的受体结合，调节卵泡和卵母细胞的发育成熟[9]。据此，我们推测在当前的IVM体外成熟培养液中添加kisspeptin可能提高卵母细胞成熟率。本研究拟通过在IVM培养液中添加重组小鼠KP52蛋白，探索其对小鼠生发泡(germinal vesicle，GV)期卵母细胞的体外成熟作用及潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

①实验动物：6周龄C57BL/6J雌鼠，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。饲养环境为恒温、半日光照半日黑暗环境(早8：00开灯，晚8：00熄灯)，所有饲料、垫料、饮水均经高压灭菌，自由饮食饮水。所有动物实验均经空军军医大学动物伦理委员会批准。②重组KP52蛋白：KISS1基因直接合成后连接于pET质粒上并表达于感受态大肠杆菌中，利用Ni柱亲和层析法将带有His标签的目的蛋白纯化出来，并利用蛋白浓缩管进行目的蛋白的浓缩，然后用二喹啉甲酸蛋白定量法检测目的蛋白浓度，以便下一步实验中的定量。③主要试剂与仪器设备：孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin，HCG)为美国Merck Millipore品牌；胎牛血清为美国Gibco品牌；矿物油、srcl2为美国Sigma品牌；M199培养基为美国HyClone品牌；透明质酸酶、M2培养液、CM培养液、KSOM培养液、rFSH均为美国Merck品牌；KP52蛋白购于上海生工生物工程股份有限公司；细胞松弛素B为美国MedChemExpress品牌；LCA-FITC为美国Invitrogen品牌；环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP) 检测试剂盒购自美国BioVision公司。

1.2 卵母细胞的收集与体外培养

6周龄C57BL/6J雌鼠于下午3：00进行腹腔注射PMSG(7.5IU/只)，48小时后脱颈处死，取出卵巢组织，于37℃提前复温的M2操作液中用1mL注射器针头戳破卵泡，在体式显微镜下挑选出形态大小均一的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)，并用M2操作液洗三次再进行下一步培养。

取出的COCs置于矿物油覆盖的IVM培养液滴中(IVM培养液需提前于37℃、5%CO2孵箱中平衡4h以上，IVM培养液为50μL/滴，每滴IVM培养液中放入30枚COCs)，于37℃、5%CO2孵箱中静置培养16～18h，通过观察其第一极体排出情况来统计成熟率。

1.3 孤雌激活与皮质颗粒染色

挑选发育成熟的MⅡ卵母细胞去除颗粒细胞后移入含5.34mg/mL srcl2的CM培养液中，并于37℃、5%CO2孵箱中培养1h后取出，用提前4h 37℃预热的KSOM培养液洗5次，再移入含5μg/mL细胞松弛素B的KSOM培养液中，并于37℃、5%CO2孵箱中培养4h，再次用提前4h 37℃预热的KSOM培养液洗5次，最后移入预平衡过的KSOM培养液中，继续于37℃、5%CO2孵箱中进行培养。

MⅡ卵母细胞去除颗粒细胞后移入4%多聚甲醛中，室温孵育30min后移入含0.02% TritonX-100、1%牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)中，室温孵育10min；然后用含7.5% BSA的PBS室温下封闭30min，再移入100μg/mL的LCA-FITC中室温下避光孵育30min进行皮质颗粒染色；而后再移入10μg/mL Hoechst中室温下孵育30min进行细胞核染色；最后用含0.1% 聚乙烯醇的PBS洗3次后封片，于倒置荧光显微镜下采集图像。

1.4 卵母细胞内cAMP水平检测

9只6周龄C57BL/6J雌鼠腹腔注射PMSG(7.5IU/只)，平均分三组，第一组48h后继续给予HCG(7.5IU/只)，然后分别于HCG后1h、2h、3h将小鼠脱颈处死后取卵巢组织进行取卵；第二、三组小鼠PMSG注射48h后立即脱颈处死取COCs，分别进行体外培养，第二组IVM培养液添加FSH，第三组培养液添加KP52蛋白，分别培养1h、2h、3h。每组取5枚去除颗粒细胞的卵母细胞经PBS洗3次后，加入500μL含1% Triton X-100的 0.1N HCl后于4℃冷藏20min，离心(4℃，10 000g)10min，收集上清液。96孔板每孔加入50μL样品上清液或配制好的标准品和50μL cAMP Reaction Mix，混匀后37℃孵育30min，然后在405 nm处测量荧光强度。

1.5 统计分析方法

2 结果

2.1 不同浓度KP52蛋白作用后卵母细胞体外成熟率的比较

为探索IVM中KP52蛋白的最合适添加量，将COCs在不含KP52蛋白的M199培养基(对照组)和含有不同浓度(0.05nmol/L、0.125nmol/L、0.25nmol/L、0.5nmol/L)KP52蛋白的M199培养液中分别培养16～18 h 后观察第一极体排出情况。结果如表1所示，与对照组相比，添加KP52蛋白可以明显提高小鼠GV期卵母细胞的体外成熟率，差异有统计学意义(F=59.725，P<0.01)，其中0.125nmol/L组与其他三种浓度的KP52蛋白组相比卵母细胞成熟率最高，因此后续实验均选择0.125nmol/L为KP52蛋白的添加浓度。

表1 不同浓度KP52蛋白作用后卵母细胞体外成熟率的比较

2.2 不同促成熟因子作用后卵母细胞成熟率的比较

为研究KP52蛋白对卵母细胞体外成熟的促进作用与传统促成熟因子FSH之间的效果差异，将COCs在含有不同促成熟因子的体外培养液中培养16～18h后观察第一极体排出情况。结果如表2所示，与IVM中的传统促成熟因子FSH相比，KP52蛋白组卵母细胞成熟率较低，但联合使用KP52与FSH可以明显促进卵母细胞的成熟(F=240.556，P<0.01)。

表2 不同促成熟因子作用后卵母细胞成熟率的比较

2.3 不同促成熟因子作用后囊胚形成率的比较

进一步探索KP52蛋白对胚胎发育潜能的影响，将COCs在含有不同促成熟因子的体外培养液中培养成熟后获得的MⅡ卵母细胞进行孤雌激活，观察其囊胚形成率。结果如表3所示，与单独添加FSH组相比，单独添加KP52蛋白组囊胚形成率显著升高(F=66.204,P<0.01)，而联合使用FSH和KP52蛋白组的囊胚形成率与单独添加KP52蛋白组相比无统计学差异。

表3 不同促成熟因子作用后囊胚形成率的比较

2.4 不同促成熟因子作用后卵母细胞胞质成熟度的比较

为探索KP52蛋白对卵母细胞胞质成熟的影响，将COCs在含有不同促成熟因子的体外培养液中培养成熟后获得的MⅡ卵母细胞进行免疫荧光染色，观察皮质颗粒分布情况。结果如图1A所示，与FSH组相比，KP52组的MⅡ期卵母细胞胞质中央的皮质颗粒向卵母细胞膜下扩散的更明显(卵母细胞胞质成熟标志之一)。对各组胞质中的皮质颗粒密度进行定量分析后也发现(图1B)，KP52组MⅡ期卵母细胞胞质中皮质颗粒密度明显降低(F=48.602，P<0.01)。

图1 不同促成熟因子作用后卵母细胞胞质成熟度的比较

2.5 不同培养方案中卵母细胞内cAMP水平的动态变化

进一步探索KP52蛋白促进卵母细胞胞质成熟的机制，通过检测GV期卵母细胞内cAMP水平发现，虽然添加KP52蛋白进行体外培养的卵母细胞中cAMP水平(0.06±0.006)显著低于体内成熟的卵母细胞(0.14±0.009)，但体内成熟的卵母细胞和添加KP52蛋白进行体外培养的卵母细胞中cAMP水平在2h 均有明显的增高，而添加FSH进行体外培养的卵母细胞内cAMP水平呈现下降趋势，详见图2。

图2 不同培养方案中卵母细胞内cAMP水平的动态变化

3 讨论

IVM技术自1991年在韩国被应用并成功诞生一名婴儿以来，全世界累计已有超过5 000例IVM试管婴儿出生。IVM技术因其安全性高、成本低、卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)风险低等诸多优势受到广泛关注，但研究发现与IVF相比，IVM卵母细胞在体外培养成熟过程中由于胞核、胞质发育成熟不同步问题导致其后续胚胎发育潜能和临床妊娠率较低。为解决这一问题，近些年大量研究者致力于优化IVM培养液或IVM培养过程等相关研究[10]。

3.1 KP52蛋白对GV期卵母细胞体外成熟的影响

既往研究发现，哺乳动物下丘脑中的kisspeptin蛋白可以通过与GnRH神经元上的受体KISS1R结合发挥对下丘脑-垂体-性腺轴的调节功能，从而影响生殖系统的内分泌功能[11]。除此之外，近些年越来越多的研究还发现，KISS1与KISS1R基因同时广泛表达于外周生殖系统如卵巢组织、子宫组织等，并且发现在卵母细胞及其周边的颗粒细胞膜表面大量表达KISS1R受体[12,13]，强烈提示kisspeptin蛋白对颗粒细胞和卵母细胞可能发挥直接调节作用。本研究通过在卵母细胞体外培养基中添加重组小鼠KP52蛋白，探索KP52蛋白在IVM中对卵母细胞成熟的影响。结果显示，KP52蛋白可以促进卵母细胞的体外成熟，虽效果并未优于传统促成熟因子FSH，但KP52蛋白可以通过提高GV期卵母细胞内cAMP水平而促进卵母细胞胞质成熟，促进卵母细胞胞质、胞核成熟的同步化，提高IVM胚胎发育潜能。

3.2 KP52蛋白促进IVM中卵母细胞胞质成熟的可能机制

环磷酸腺苷(cAMP)在细胞信号转导中起着关键作用，卵母细胞中高浓度的cAMP通过抑制成熟促进因子的激活维持减数分裂的停滞，促进卵母细胞胞质的发育和成熟，调节卵母细胞胞质胞核成熟同步化[14-16]。Albuz F.K等人[16]通过在IVM培养前将牛或小鼠的COCs用腺苷酸环化酶激活剂forskolin处理后增加卵母细胞内cAMP水平，从而显著提高了牛和小鼠的囊胚形成率、囊胚质量、着床率等。我们的实验结果也证明GV期卵母细胞内cAMP水平的提高可以通过促进卵母细胞胞质成熟而改善囊胚形成的数量和质量。体外添加KP52蛋白可以模拟出卵母细胞体内发育过程中出现的cAMP激增过程，从而延缓减数分裂的进程，促进胞质的成熟，改善成熟卵母细胞的质量和后续发育能力。临床研究发现，KP54蛋白体内注射后可以通过提高多囊卵巢综合征患者颗粒细胞上FSH受体、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)受体以及雌激素受体表达量，从而在不引起OHSS发生的情况下仍能获得大量成熟卵母细胞[17,18]。但在体外培养环境下，kisspeptin蛋白对卵母细胞和颗粒细胞的作用和影响及可能机制仍处于未知的状态。我们的研究结果提示体外添加KP52蛋白可能通过直接与颗粒细胞和卵母细胞上的KISS1R受体结合，促进卵母细胞内cAMP水平的升高，提高卵母细胞胞质成熟度及成熟卵母细胞质量，从而改善IVM卵母细胞胚胎发育潜能，提高IVM临床妊娠率。

综上所述，我们的研究结果为进一步改善体外成熟卵母细胞质量提供了新的思路和方法，初步揭示了kisspeptin蛋白对小鼠卵母细胞的体外成熟作用，为探索更加有效的IVM培养液提供了新的实验证据，有助于向人类辅助生殖技术临床转化应用。