于 花 晋海军 张 嘉 朱 姗

（1.贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学中药民族药资源研究院，贵州 贵阳 550025）

川续断（Dipsacus asperoidesC.Y.Cheng et T.M.Ai）为川续断科川续断属药用植物，其干燥根具有补肝肾、强筋骨及续折伤的功效[1]。随着续断药材市场需求的日益增加，导致其供不应求局面逐渐形成[2]。在贵州、湖北和云南等省出现了川续断人工种植基地，但基地种源混杂、品种混乱，导致川续断的种质退化问题日趋严重[3]。目前，选育品质优良的川续断种苗是解决其种质退化的关键，而植物组织培养技术则是解决育种过程中种苗快繁的有效途径之一[4]。植物组织培养外植体的预处理是此类实验成功的关键因素之一[5]，本研究拟通过对川续断组织培养外植体消毒技术研究，获得川续断外植体消毒的最佳方式，为今后建立高效的川续断组织培养体系提供技术资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本研究所用川续断外植体（一年生叶）采自贵州中医药大学中草药种质资源圃。

1.2 实验方法 植物组培过程中，外植体预处理一般包括流水冲洗、75%酒精消毒和0.1%升汞消毒，而后切分外植体转入培养基。

1.2.1 单因素试验

1.2.1.1 流水冲洗 将野外采集的川续断叶片转入网兜，分别用流水冲洗0.5 h、1 h、2 h、3 h 和4 h，而后用滤纸吸干叶片表面水分。用75%酒精浸泡10 s，再转到0.1 %升汞中，15 min，然后用无菌蒸馏水冲洗4 次，转入垫有滤纸的平皿（已消毒）将外植体切分成1.5 cm×1.5 cm 小块，接入MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 1.00 mg/L的MS 培养基中。培养条件：温度（25± 1）℃，光照时间8 h/d，光照强度1500 Lux，湿度60%的恒温培养箱。40 d后统计愈伤诱导率（愈伤诱导率=愈伤外植体数/ 接种外植体总数×100%）。

1.2.1.2 75%酒精消毒 将流水冲洗2 h 的叶片用75%的酒精分别处理5 s、10 s、15 s、20 s、25 s，双蒸水冲洗3 遍，转入0.1%升汞消毒15 min。按照1.2.1.1 方式切分外植体并转入愈伤相应培养基诱导，培养条件同1.2.1.1。

1.2.1.3 0.1%升汞消毒 将流水冲洗2 h，75%的酒精处理10 s 的叶片用双蒸水冲洗3 遍，转入装有0.1%升汞的玻璃瓶，分别处理5 min、10 min、15 min、20 min、25 min。双蒸水冲洗3 遍，按照1.2.1.1 方式切分外植体并转入愈伤相应培养基诱导，培养条件同1.2.1.1。

1.2.2 响应面试验 以流水冲洗时间、75%酒精和0.1%升汞处理时间为因素，在单因素试验的基础上，每个因素设计3 个水平，以愈伤组织诱导率为响应值（见表1），用Design Expert V 8.0.6 软件的Box-Behnken 实验方案（见表2）进行响应面优化。按照1.2.1.1 方式切分外植体并转入愈伤诱导培养基MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 1.00 mg/L，培养条件同1.2.1.1。40 d 后统计愈伤诱导率。

表1 不同预处理方式的Box-Behnken 试验因素水平

表2 不同预处理方式的Box-Behnken 试验

1.2.3 数据处理 本实验运用Design Expert V 8.0.6软件的Box-Behnken 试验设计模块对川续断愈伤组织诱导前的预处理方式进行优化。

2 结果

2.1 单因素试验结果 植物愈伤组织诱导过程中，实验的预处理对降低外植体污染率，提高愈伤诱导率具有重要作用。在川续断组培实验预处理过程中，流水冲洗最佳时间为1 h，75%酒精最佳处理时间为10 s，0.1%升汞最佳处理时间为15 min。见图1。

图1 单因素试验结果

2.2 响应面试验结果 以流水冲洗时间（A）、75%酒精（B）及0.1%升汞（C）消毒时间为因素，愈伤诱导率为响应值，构建二次回归方程：愈伤诱导率=（95.11+4.57）×（A+3.00×B）+（1.69×C）-（1.41×A×B）-（9.67×A×C）-（1.99×B×C）-（34.17×A2）-（16.23×B2）-（3.80×C2）。

通过对回归方程的显著性分析（见表3），流水冲洗时间（A）、75%酒精（B）及0.1%升汞消毒（C）时间对愈伤组织诱导的线性效应极显著（P ＜0.01），不同因素对愈伤诱导的影响顺序为：A＞B＞C，AB对愈伤诱导率的交互影响显著，AC 及BC 对愈伤诱导率的交互影响极显著。方程的预测模型显著性水平P ＜0.000 1，说明方程模型极显著；R2=0.998 8，失拟项（P ＝0.2606 ＞0.05）不显著，表明模型具有较高可信度及拟合度，可用此方程替代实验真实点，对愈伤诱导的预处理过程进行预测和分析。

表3 愈伤组织诱导的回归方程显著性检验及方差分析

依据不同预处理方式对愈伤诱导率的响应面分析，得到川续断愈伤诱导的最佳预处理方式为：流水冲洗1.02 h，75%酒精10.41 s，0.1%升汞15.72 min，预测得到愈伤诱导率为：98.6%。为验证预测结果可靠性，在最佳预处理方式下，愈伤组织诱导率为95.32%，此诱导率与预测值的相对误差为3.44%，说明此响应面优化法得到的不同预处理方式真实可靠。见图2。

图2 不同预处理方式对愈伤诱导的响应面分析

3 讨论

植物组培过程中预处理是影响整个组培过程的关键因素[6]，常用的外植体预处理方式流水冲洗、酒精消毒、肥皂水清洗、升汞消毒及青霉素钠浸泡等方式[7]。宋微等[8]报道，铁线莲组培时，外植体流水冲洗1 h 效果较好。特有濒危药用植物羌活离体培养时，叶片的最佳灭菌方法就包含75%酒精处理10 s[9]。陈灿[10]对白芨进行组培研究时，发现0.1%升汞对外植体预处理15 min，消毒效果较好。本研究采用响应面优化法，获得川续断叶片预处理最佳方式为：流水冲洗1.02 h，75%酒精10.41 s，0.1%升汞15.72 min，本研究结果与上述文献报道结果基本一致。

本研究筛选的川续断组培最佳预处理方式，可为今后建立高效的川续断快繁体系提供基础资料。