靖林林，刁建新，徐一华，曾志云，邱婷婷，吴秀琼，孙学刚，项小军 南方医科大学中西医结合医院手术室，广州505； 南方医科大学中医药学院； 南方医科大学南方医院医院感染管理科

缺血性压疮是骨隆突部、骶尾部皮肤、皮下组织长期受压而产生的难愈性溃疡，是手术后患者常见的并发症。缺血性压疮发生的主要原因是局部组织持续性缺血、缺氧，并最终引起局限性破坏和坏死，因此血液循环与组织修复障碍是缺血性压疮发生的核心机制［1-2］。2019 版《压疮/压力性损伤的预防和治疗：临床实践指南》中建议，临床可以使用非药物治疗作为减轻压力性损伤疼痛的首要方法，可见缺血性压疮没有特效药物，首选是对症治疗，即减轻疼痛。中药山稔子具有收敛止血、活血解毒之功，可以治疗皮肤出血、溃烂等［3］。2020 年9 月—2021 年5月，本研究观察了山稔子油敷剂对缺血性压疮小鼠的治疗作用，并探讨其机制是否与抗炎、消肿、瘢痕修复等有关。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF 级雄性KM 小鼠70 只，8～12 周龄，体质量23～25 g，由南方医科大学实验动物中心提供；实验动物饲养于南方医科大学动物中心SPF级环境中，温度18～24 ℃，适应性喂养3 d。药物制备：山稔子采摘于河源市龙川县新田镇羊山，由本单位鉴定教研室陈兴兴鉴定为桃金娘科植物桃金娘的果实，系山稔子正品；将其晒干后炒炭，研磨成粉末，200 目的过滤筛筛选，研磨后再用100 目的过滤筛过滤；称取30 g 过滤好的山稔子粉末，加入30 g 山茶油调和，最终制成油敷剂，4 ℃冰箱保存。主要试剂：白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素10（IL-10）ELISA 试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司；血管内皮生长因子（VEGF）、Ⅰ型胶原蛋白（COL-Ⅰ）、Ⅲ型胶原蛋白（COL-Ⅲ）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子β（TGF-β）抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组化试剂盒购自香港基因公司。

1.2 动物分组、建模及干预处理 取SPF 级雄性KM 小鼠60 只，参照KASUYA 等［4］的方法建立小鼠缺血性压疮模型，方法如下：小鼠实验前24 h背部脱毛2 cm×2 cm，10%水合氯醛400 mg/kg 腹腔麻醉，75%乙醇消毒，将两个直径1.2 cm、厚度0.5 cm 的圆形磁铁夹住小鼠背部的皮肤，持续16 h，取下磁铁。将60只缺血性压疮小鼠随机分别为模型组、山稔子油敷剂组、安尔碘组，每组20 只，另取SPF 级雄性KM小鼠10只作为正常对照组。山稔子油敷剂组建模后局部涂抹山稔子油敷剂，将等量油敷剂均匀擦涂于皮肤夹伤处，模型组与安尔碘组分别局部涂抹等量的生理盐水与安尔碘Ⅱ型皮肤消毒剂，2 次/天。正常对照组不予特殊处理。各组用苦味酸标记，分笼饲养，实验期间小鼠自由进食、饮水。

1.3 皮肤创面情况观察 ①创面大体情况：观察模型组、山稔子油敷剂组、安尔碘组分组处理14 d内皮肤红肿、渗出、水泡等创面大体情况。②创面愈合情况：三组分别于分组处理0、7、14 d，采用格子法测量创面面积。

1.4 皮肤创面病理改变观察 正常对照组分组处理当天收集正常皮肤组织，模型组、山稔子油敷剂组、安尔碘组分组处理0、7、14 d测定创面面积后收集创面皮肤组织，10%甲醛固定，顺次进行包埋、切片，切片厚度为4µm，行常规HE染色。应用倒置显微镜随机选取5个视野，观察各组皮肤组织炎症细胞浸润情况及组织汗腺、毛囊结构、表皮细胞结构变化。

1.5 血清IL-10、IL-6 水平检测 采用ELISA 法。各组分组处理7、14 d，采集眼球血800～1 200 µL，4 ℃条件下3 000 r/min 离心15 min，取 上层血清，-80 ℃超低温冰箱保存。采用ELISA 法检测血清IL-10、IL-6水平，严格按照试剂盒说明书操作。

1.6 皮肤创面组织VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、bFGF、TGF-β 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。各组分组处理7、14 d，采集眼球血后取皮肤创面组织，液氮组织研磨法提取皮肤组织总蛋白。BCA 蛋白定量，取50 µg 蛋白行SDS 凝胶电泳，转膜、封闭后顺次加入一抗、二抗，超敏ECL 化学发光。应用Kodak 2000MM 图像工作站成像分析条带灰度值，以β-actin 为内参，计算目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料采用偏度—峰度正态性检验方法，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮肤创面大体情况比较 分组处理后，三组小鼠皮肤创面均呈现急性炎症状态，主要表现为皮肤显著红肿、创面持续渗出，有不同大小水泡形成。分组处理7～14 d，与模型组相比，山稔子油敷剂组与安尔碘组红肿、渗出显著减轻，局部水泡数量与大小均减轻，但山稔子油敷剂减轻更明显；山稔子油敷剂组创面逐步结痂，创面面积显著缩小后完全脱痂，创面边缘开始有新生毛发覆盖，安尔碘组有个别小鼠未完全脱痂。

2.2 各组小鼠皮肤创面面积比较 见表1。

表1 各组小鼠分组处理后皮肤创面面积比较（mm2，±s）

表1 各组小鼠分组处理后皮肤创面面积比较（mm2，±s）

注：与模型比较，*P＜0.05；与安尔碘组比较，#P＜0.05。

组别模型组山稔子油敷剂组安尔碘组n 20 20 20 0 d 226.1± 8.2 226.4±11.5 223.5± 9.2 7 d 159.5±12.5 76.8±15.8*96.6±12.6*#14 d 65.7±16.5 24.3±11.3*54.5±16.7*#

2.3 各组小鼠皮肤创面病理改变比较 分组处理0 天，正常对照组表皮、真皮组织结构清晰可见。分组处理7 d，模型组皮肤表皮、毛囊结构缺失，真皮层充血、水肿，胶原纤维肿胀融合、断裂，纤维中有大量炎症细胞浸润；山稔子油敷剂组和安尔碘组皮肤炎症改变较模型组减轻。分组处理14 d，模型组真皮层内形成肉芽肿，轻度角化过度，伴有棘层肥厚；山稔子油敷剂组表皮增生，角质分化，形成假性角囊肿，毛囊结构逐渐形成；安尔碘组表皮增生，伴有轻度角化过度及棘层肥厚。见OSID 码图1。

2.4 各组小鼠血清IL-6、IL-10水平比较 见表2。

表2 各组小鼠血清IL-6、IL-10水平比较（pg/mL，±s）

表2 各组小鼠血清IL-6、IL-10水平比较（pg/mL，±s）

注：与正常对照组同时间点比较，*P＜0.05；与模型组同时间点比较，#P＜0.05；与安尔碘组同时间点比较，△P＜0.05。

组别正常对照组分组处理7 d分组处理14 d模型组分组处理7 d分组处理14 d山稔子油敷剂组分组处理7 d分组处理14 d安尔碘组分组处理7 d分组处理14 d n 10 20 20 20 IL-6 20.14± 3.13 19.49± 2.56 198.83±12.11*77.83± 9.86*109.74± 9.73*#53.58±11.47*#129.64± 8.93*#△63.56± 9.75*#△IL-10 148.54± 9.14 149.49± 9.55 74.04± 8.84*69.19± 7.37*93.58±14.8*#89.38± 6.15*#81.54± 9.23*#△73.39± 7.85*#

2.5 各组小鼠皮肤创面组织VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、bFGF、TGF-β蛋白表达比较 见表3、OSID码图2。

表3 各组小鼠皮肤创面组织VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、bFGF、TGF-β蛋白表达比较（±s）

表3 各组小鼠皮肤创面组织VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、bFGF、TGF-β蛋白表达比较（±s）

注：与正常对照组同时间点比较，*P＜0.05；与模型组同时间点比较，#P＜0.05；与山稔子油敷剂组同时间点比较，△P＜0.05。

组别正常对照组分组处理7 d分组处理14 d模型组分组处理7 d分组处理14 d山稔子油敷剂组分组处理7 d分组处理14 d安尔碘组分组处理7 d分组处理14 d n 10 20 20 20 VEGF 0.449±0.010 0.404±0.008 0.055±0.011*0.329±0.011*0.456±0.018#0.476±0.015*#0.404±0.008#△0.409±0.014#△COL-Ⅰ0.339±0.016 0.395±0.015 0.215±0.004*0.447±0.014*0.254±0.002*#0.436±0.015*0.395±0.015#△0.425±0.009 COL-Ⅲ0.963±0.016 1.011±0.011 0.073±0.004*0.898±0.014*0.526±0.009*#1.063±0.012*#1.011±0.011△0.968±0.018*#△bFGF 0.308±0.010 0.308±0.010 0.103±0.008*0.243±0.020*0.272±0.008*#0.297±0.015#0.308±0.010 0.267±0.010*TGF-β 0.902±0.017 0.947±0.020 0.290±0.013*0.565±0.018*0.547±0.027*#0.773±0.005*#0.947±0.020 0.797±0.016*#

3 讨论

血脉瘀滞、痰凝毒聚是缺血性压疮的核心病机，因此对压疮的治疗策略应以清热解毒、活血化瘀为主［5］。山稔子又称岗稔，为药用植物桃金娘的果实，盛产岭南地区［6］。《本草纲目遗失》记载山稔子具有收敛止血的作用，主治咳血、皮肤出血、溃烂等。广东省山区常用山稔子外敷治疗烧伤，具有良好的疗效。本研究结果显示，山稔子油敷剂可有效缩小缺血性压疮小鼠的皮肤创面面积，加快皮肤脱痂，促进皮肤修复；病理结果显示其能够增加肌纤维覆盖，减少淋巴细胞以及单核细胞浸润，对缺血性压疮小鼠的治疗效果较好。

缺血性压疮的主要治疗措施是创面处理和早期修复，而创面处理主要是清除异物、抗炎、促创面修复。血管生成是创面修复的基础，VEGF 是最强的促血管内皮细胞有丝分裂原，是血管生成的一个重要调节因素［7-8］。缺血性压疮的修复一定程度上是肉芽组织中各种修复细胞增殖、成纤维细胞产生大量胶原，从而修补创面的过程［9］。胶原是创面组织中的主要基质成分，其作为细胞生长的依附和支撑物，能诱导上皮细胞增殖、分化和移行［10］。皮肤中的胶原蛋白主要有Ⅰ型和Ⅲ型，COL-Ⅰ纤维粗大，位于真皮浅层，是烧伤创面瘢痕组织纤维化的物质基础；COL-Ⅲ纤维细小，主要位于真皮深层，含量比较高［11-12］。COL-Ⅰ和COL-Ⅲ胶原纤维含量比与烧伤创面无瘢痕愈合呈负相关关系［13］。本研究结果显示，山稔子油敷剂能显著促进缺血性压疮小鼠皮肤创面组织VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达，提高VEGF 表达可促进血管生成，有利于胶原蛋白的重构，COL-Ⅲ表达升高可促进细小纤维蛋白生成，从而达到减少疤痕形成、改善缺血性压疮的作用。IL-6 与IL-10 在控制伤口炎症和瘢痕形成中具有关键作用［14］。研究显示，IL-6 可导致小鼠伤口愈合延迟［15］。IL-10 可抑制炎症和瘢痕组织的形成，IL-10 表达升高可以加速伤口再上皮化，促进伤口肉芽组织覆盖，改善伤口血运重建［16］。本研究显示，山稔子油敷剂作用7 d 即可通过降低血清IL-6、升高IL-10 而减轻缺血性压疮小鼠的炎症反应。

bFGF具有促进创面愈合的作用，不仅可以释放生长因子，同时可以释放胶原酶等有关基质蛋白酶，分解、清除损伤创面变性坏死的细胞及细胞外基质成分，为新生上皮的爬行、细胞增殖创造环境［17］。本研究结果显示，山稔子油敷剂可显著增加缺血性压疮小鼠皮肤创面组织bFGF 蛋白表达。因此，山稔子油敷剂促进创面愈合的机制可能是增加bFGF 及胶原酶等有关基质蛋白酶表达，从而分解、清除缺血性压疮导致的创面变性坏死细胞及其基质成分，为新生上皮爬行、细胞增殖创造环境，最终促进创面的修复。TGF-β 与伤口修复愈合密切相关，可以促进成纤维细胞迁移、增殖，并促进细胞外基质的分泌，诱导血管内皮细胞形成毛细血管，减少伤口处细胞外基质的酶解，是促进伤口肉芽组织形成和胶原沉积的重要因素之一。同时，TGF-β 可以诱导单核细胞趋化、活化、产生其他活化因子，清除细菌和坏死组织，并促进上皮细胞再生、分化、连接。本研究结果显示，山稔子油敷剂可显著增加缺血性压疮小鼠皮肤创面组织TGF-β 蛋白表达，其可能通过TGF-β促进成纤维细胞迁移、增殖，并促进其合成、分泌细胞外基质，诱导血管内皮细胞形成毛细血管，从而促进伤口肉芽组织形成和胶原沉积。

综上所述，山稔子油敷剂可提高缺血性压疮小鼠皮肤组织VEGF、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、bFGF、TGF-β蛋白表达，其可能通过促进血管生成及胶原蛋白合成、降低炎症反应等机制促进缺血性压疮小鼠的皮肤创面愈合。