赵路瑶，李慕然，刘艳迪

(1.南开大学医学院，天津 300071； 2.天津市人民医院消化科，天津 300121)

胃癌具有高发病率、高病死率的特点，2018年世界卫生组织国际癌症研究机构发布的全球癌症统计报告指出，胃癌发病率居恶性肿瘤第5位，病死率居第3位[1]。近年来，我国胃癌的发病率有所下降，但人口增长和老龄化导致的新发病例数量大幅上升。胃癌是我国第三大恶性肿瘤，病死率居恶性肿瘤的第2位[2]。我国胃肠道恶性肿瘤的相关死亡率明显高于西方国家，其主要原因为确诊较晚，约80%的胃癌患者确诊时已为中晚期，即使接受以手术为主的综合治疗，5年生存率仅为30%～40%[3]。而早期胃癌患者的5年生存率超过90%[4]。因此，在临床前或症状前阶段发现并确诊是成功治疗和改善胃癌患者预后的关键。

目前，胃癌的确诊仍依靠胃镜下病变组织的病理组织检查，而胃癌分期分级依赖影像学检查。内镜与影像学检查均受诊断医师经验、水平等因素的影响，缺乏量化标准。临床常用的肿瘤标志物癌胚抗原、糖类抗原(carbohydrate antigen，CA)19-9和CA72-4等虽然可以量化，但其胃癌检出率仅约20%[5-6]。因此，迫切需要寻找简便易行、敏感高效的胃癌检测手段。环指蛋白(ring finger protein，RNF)180基因是一种抑癌基因，其甲基化与多种恶性肿瘤的恶性生物学行为相关[7-11]。外周血RNF180基因甲基化水平诊断胃癌的灵敏度和特异度较高，可能成为胃癌特异性生物标志物[7]。现对外周血RNF180基因甲基化检测在胃癌临床诊断中的研究进展予以综述，以期为RNF180基因甲基化检测在胃癌诊断中的价值提供新的理论基础和研究方向。

1 RNF180概述

RNF180基因在人类基因组中定位于5q12.3，是一种受DNA甲基化调控的抑癌基因[12]。由RNF180基因编码的RNF180蛋白与其他RNF家族成员均具有E3泛素连接酶活性，且属于环指型E3s，其结构含有1个环指结构域、1个碱基卷曲结构域(两者可与蛋白质结合)、1个保守结构域(DSPRC)和1个被预测为跨膜区的C端疏水区[13]。见图1。

注：DSPRC为新保守结构域，basic coiled-coil domain为基本螺旋结构域，RING finger domain为环指结构域，TM为C端疏水区

在泛素蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system，UPS)中，经过E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶等参与的具有高度特异性的级联酶促反应作用后，泛素化蛋白质最终被26S蛋白酶体降解，以保持细胞内蛋白质代谢的动态平衡[14]。RNF180是E3泛素连接酶的成员，在UPS的功能中起着关键作用，决定了UPS泛素化的靶向特异性和时序性以及随后蛋白质的降解过程[13,15]。同时，RNF180通过对自身泛素化进行自我调节，避免细胞内E3泛素连接酶浓度过高。RNF180参与了多种生理和病理过程，通过介导蛋白降解在细胞信号转导、细胞凋亡、基因转录及修复中发挥不可替代的作用，如肿瘤抑制因子、转录活化因子、细胞周期调节因子以及突变产生的癌蛋白或受损蛋白质是UPS泛素化降解的靶蛋白[16]。当RNF180基因甲基化时，RNA聚合酶不能有效地与RNF180启动子结合，从而导致转录抑制、翻译受损[17]，RNF180表达减少，引起E3泛素连接酶功能障碍和UPS失调，失调的UPS可终止蛋白质降解过程，引起细胞代谢紊乱，机体蛋白质降解受限达到一定水平时，可能导致肿瘤的发生。此外，在肿瘤的发生发展中，甲基化累积持续进行，最终导致多种恶性生物学行为产生[18]。

2 RNF180相关的癌症作用机制

从病因学角度看，幽门螺杆菌是一种参与胃癌发生的Ⅰ类致癌物[19-20]。Han等[21]研究发现，在不同的疾病条件下，幽门螺杆菌感染可能改变RNF180基因启动子的甲基化方式，在正常或浅表性胃炎中，幽门螺杆菌倾向于影响总体甲基化状态，而不会使某些CpG位点甲基化；但在萎缩性胃炎中，幽门螺杆菌影响某些CpG位点的可能性更大。进一步的研究证实，有5个CpG位点与萎缩性胃炎进展相关，其中两个位点的甲基化与胃癌进展相关，这些位点均位于RNF180基因的核心启动子区域(-202/+372)，该区域也是RNF180基因转录起始位点[16,22]。故认为，幽门螺杆菌通过促进RNF180基因甲基化参与慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生、异型增生到肠型胃癌的演变。

RNF180与胃癌的关系一直是研究热点，但对其致癌机制的研究很少。Cheung等[22]的研究显示，受检的胃癌细胞系中均未发现RNF180基因的缺失或突变，认为启动子高甲基化是降低RNF180表达的主要机制；RNF180可通过上调组织金属蛋白酶抑制物3和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A激活细胞凋亡，并通过上调肿瘤转移抑制因子1和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子2A抑制细胞增殖。Deng等[23]利用基因芯片技术的研究显示，RNF180在HGC-27-GFP-RNF180细胞(转染RNF180表达载体的HGC-27胃癌细胞)中重新表达，可显著抑制涉及增殖(肝细胞生长因子)、侵袭(基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶14)、淋巴管生成(血管内皮生长因子C和血管内皮生长因子D)、胃癌细胞趋化性细胞因子(CC趋化因子受体7)基因的表达，表明RNF180可能成为胃癌的治疗靶点。由此可见，RNF180基因甲基化可通过影响多种细胞因子、癌蛋白调控癌细胞生物学行为。

涉及RNF180致癌机制的4条信号通路分别为RNF180/RhoC/磷酸化的信号转导及转录活化因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)、RNF180/Wnt1诱导信号通路蛋白1(Wnt1-inducible signaling pathway protein 1，WISP1)、RNF180/Polo样激酶2和RNF180/DNA甲基转移酶3A(DNA methyltransferase 3A，DNMT3A)/含凝血酶敏感素基序的去整合素金属蛋白酶 9(A disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs 9，ADAMTS9)。Wu等[24]研究发现，RNF180可结合RhoC并通过泛素化作用降解RhoC。RhoC通过磷酸化活化STAT3生成磷酸化的STAT3，后者发生二聚化后扩散到细胞核中，与Nanog的启动子区结合，开启基因表达。而肝细胞生长因子、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶14、血管内皮生长因子C、血管内皮生长因子D相关基因是STAT3的靶基因。因此，磷酸化的STAT3水平下降可有效抑制胃癌细胞的增殖和侵袭，进而抑制肿瘤生长和转移。Wei等[8]对RNF180与结直肠癌关系的研究发现，WISP1是介导RNF180肿瘤抑制作用的关键下游分子。在机制上，RNF180中位点Lys50、Lys190、Lys268的泛素化可使WISP1泛素化，导致WISP1下调，进而减弱WISP1诱导的细胞增殖，最终抑制人源性肿瘤组织异种移植小鼠模型结直肠癌肿瘤的生长。

此外，5-氟尿嘧啶和RNF180在诱导细胞凋亡和抑制肿瘤生长方面有协同作用。RNF180不能完全消除WISP1的影响，这意味着WISP1信号转导中可能存在替代介质或途径。Cao等[11]在神经胶质瘤细胞中发现，RNF180可与Polo样激酶2结合并促进Polo样激酶2泛素化降解，抑制胶质瘤细胞增殖，促进凋亡。DNMT3A是一种甲基转移酶，与ADAMTS9基因启动子的高甲基化密切相关。Sun等[25]发现，ADAMTS9可抑制胃癌细胞存活、迁移和侵袭，进一步的共免疫沉淀实验显示，RNF180可与DNMT3A结合，泛素化分析结果显示，RNF180过表达时，DNMT3A泛素化增强，证实DNMT3A是RNF180的直接底物，RNF180通过促进DNMT3A蛋白的泛素化降解，恢复胃癌细胞中ADAMTS9的表达，从而抑制胃癌细胞的存活。上述信号通路均涉及RNF180的泛素化作用，且许多参与重要细胞生物学过程的因子、关键酶均是RNF180下游分子，其中多种基因及信号通路相互影响，形成复杂的分子网络系统，因此还需进一步探索RNF180抑制胃癌恶性生物学行为的其他通路。进一步研究RNF180上下游分子信号将为寻找胃癌治疗新靶点、延长胃癌患者生存期提供理论基础。

3 胃癌中外周血RNF180甲基化的临床检测

胃癌组织中RNF180信使RNA及蛋白质表达水平的检测是既往研究的热点，结果显示，胃癌组织中RNF180信使RNA及蛋白质表达水平与胃癌发生密切相关，且病变组织水平显著低于相应癌旁组织[7,23,26]。外周血取材方便，故外周血RNF180甲基化水平检测被认为是胃癌诊断的新方法。Cheung等[22]在研究胃癌细胞株及胃癌组织的同时，利用定量聚合酶链反应技术检测胃癌患者血浆标本发现，56%(18/32)的患者血浆标本存在RNF180基因甲基化，而健康人群血浆中未检测到RNF180基因甲基化，受试者工作特征曲线下面积为0.685，灵敏度为91%，特异度为63%；Logistic回归分析证实，RNF180基因甲基化与胃癌高风险相关(OR=16.1，95%CI5.3～48.6)。可见，外周血可显示RNF180基因甲基化信息，且更易获取，故外周血DNA甲基化水平的检测为无创胃癌检测提供了新途径。研究显示，与健康对照者相比，胃癌患者的血浆RNF180基因甲基化率明显升高，且甲基化程度与肿瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴结转移以及远处转移相关[27-28]。但张学松等[28]利用酶联免疫吸附试验检测RNF180基因的表达水平发现，与健康人群相比，胃癌患者血浆RNF180蛋白表达水平明显降低，但蛋白质表达水平与上述临床病理学特征并无统计学联系，其原因可能是RNF180可通过基因甲基化之外的方式调控基因表达，如基因突变、组蛋白修饰去乙酰化。在基因表达水平上，蛋白质与病理特征无关，但以上结果仍提示外周血RNF180基因甲基化检测是一种简便且具有应用价值的胃癌诊断方法。宋毓飞等[29]采用甲基化特异性聚合酶链反应进行研究显示，53.7%(36/67)的胃癌患者RNF180基因甲基化呈阳性表达，而仅23.5%(12/51)的正常健康体检者RNF180基因甲基化呈阳性表达，甲基化与肿瘤分化程度、TNM分期显著相关，但不同性别、年龄胃癌患者RNF180基因甲基化水平比较差异无统计学意义；Logistic回归分析显示，RNF180基因甲基化水平与胃癌高风险相关(OR=3.0，95%CI1.3～7.0)。曹长琦等[30]对74例早期胃癌患者的研究显示，早期胃癌组患者的RNF180基因甲基化阳性率显著高于胃良性疾病组和健康对照组(32.4%比13.1%、5.3%)(P<0.01)，其受试者工作特征曲线下面积为0.636，但未发现RNF180基因甲基化与性别、年龄、Lauren分型、病理分化程度、解剖位置、浸润深度及淋巴结转移等临床病理特征有关，以上研究结果的差异可能与不同试验检测方法、试剂盒对研究结果的影响不同有关。

虽然检测胃癌患者外周血RNF180基因甲基化水平存在一定的假阳性率，但其诊断价值仍高于传统肿瘤标志物。将RNF180与其他具有诊断效能的基因联合进行甲基化检测是提高胃癌诊断灵敏度和特异度的方法。Zhang等[27]比较外周血RNF180、死亡相关蛋白激酶1以及分泌型卷曲相关蛋白2单一基因检测和多基因联合检测诊断胃癌的效能，结果显示，外周血RNF180与分泌型卷曲相关蛋白2联合检测诊断胃癌的灵敏度和特异度分别为85.96%和47.62%，可显著提高胃癌临床诊断率，适用于胃癌的诊断。宋毓飞等[29]认为，外周血RNF180和分泌型卷曲相关蛋白2联合检测胃癌的灵敏度和特异度分别为42.7%和88.2%，优于单一检测。曹长琦等[30]发现，血浆Septin 9、RNF180联合甲基化检测诊断早期胃癌的灵敏度为40.5%，特异度为85.3%，较任一基因单独检测的灵敏度明显升高；且不同检测手段诊断胃癌的阳性率依次为Septin 9联合RNF180、RNF180、Septin 9、CA724、CA125、癌胚抗原、CA19-9。由此可见，早期检测Septin 9与RNF180基因甲基化可作为一种临床可行的简便检测方法，用于胃部病变良恶性的辅助鉴别。临床试验显示，该试剂盒检测胃癌的灵敏度为61.76%(420/680)、特异度为85.07%(456/536)[31]。2020年4月国家药品监督管理局批准胃癌筛查RNF180/Septin 9基因甲基化检测试剂盒上市[32]。在临床实践中，两种及两种以上基因甲基化检测似乎更加具有可行性。因此，寻找其他具有更高灵敏度的基因学标志物是未来肿瘤诊断学的研究方向。

4 小 结

RNF180基因表达水平随甲基化水平改变，并促进胃癌的发生发展。外周血RNF180基因甲基化检测有助于发现早期胃癌，且其检测胃癌的灵敏度高于传统肿瘤标志物[30]。外周血RNF180基因甲基化检测在胃癌诊断、预测恶性生物学行为中具有重要价值，但其通过甲基化发挥促癌作用的具体机制仍不明确。目前与胃癌相关的分子标志物主要包括癌基因、抑癌基因、DNA甲基化、微RNA、长链非编码RNA、环状RNA、循环肿瘤细胞、循环肿瘤DNA、外泌体等[33]。未来，基于肿瘤分子或免疫组织化学特征的检测方法可通过优化外周血RNF180基因甲基化检测技术发掘其他具有高特异度和灵敏度的标志物并进行联合检测，以进一步探索定量、定性基因甲基化水平与胃癌的关系，拓展其在胃癌早期诊断中的应用。