韦光楠，廖宁，陈博

(1.华南理工大学医学院，广州 510006； 2.广东省人民医院 广东省医学科学院乳腺外科，广州 510080)

根据全球流行病学调查显示，乳腺癌在女性中的发病率呈逐年上升趋势[1]。其中人类表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptor,HER)2过表达型发病率为15%～20%，因易发生脑转移，患者预后较差。抗HER2靶向药物治疗的效果较好，但肿瘤耐药的发生大大缩短了患者的生存期[2-3]。HER3/ERBB3作为HER家族中的一员，能与HER2形成异源二聚体，该二聚体在HER家族异源二聚体中活性最强。HER2/HER3异源二聚体的形成能激活下游信号通路，促进肿瘤细胞增殖、分化[4-5]。当ERBB3形成异二聚体且被磷酸化后，胞内暴露出的6个磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)亚基结合位点能够募集PI3K至调节亚基位点，进而激活下游PI3K/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)信号通路，导致肿瘤耐药的发生[6]。因此，ERBB3基因作为乳腺癌治疗的另一个可行靶点越来越受到重视[7]。CLEOPATRA临床研究发现，ERBB3过表达与患者的不良预后相关，但进一步分析发现，ERBB3并不能预测药物治疗对患者是否获益[8-9]。在基础研究中发现ERBB3错义突变能增强ERBB2/ERBB3异源二聚体的活性，从而促进肿瘤生长，导致抗HER2治疗耐药的发生[10]。目前对于ERBB3基因在乳腺癌中的研究结果尚不统一，对乳腺癌的治疗效果仍不明确[11-12]。因此，本研究通过体外细胞实验验证ERBB3基因突变可能对乳腺癌细胞造成的影响，为后续进一步研究ERBB3基因在乳腺癌细胞中的作用提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 纳入2017年6月至2019年5月就诊于广东省人民医院经病理确诊为乳腺癌的患者384例。免疫组织化学雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体任一项阳性定义为激素受体(hormone receptor,HR)阳性，其中HR-/HER2-患者50例，HR-/HER2+患者43例，HR+/HER2-患者227例，HR+/HER2+患者64例。本研究获得广东省人民医院伦理委员会批准，患者均签署了知情同意书。

1.2方法

1.2.1主要仪器与试剂 Nextseq500测序平台(美国Illumina公司)，高速离心机Z230MR(德国HERMLE公司)，Bio-Rad T100聚合酶链反应仪、中型垂直电泳系统、B107蛋白印迹成像分析系统均购自美国Bio-Rad公司，细胞培养二氧化碳孵育箱和超净工作台(美国Thermo公司)，DKZ-1恒温水浴箱(上海一恒科技有限公司)，JY96-IIN超声裂解细胞仪(上海沪析公司)。核酸提取及纯化试剂盒、基因测序用文库试剂盒均购自美国Agilent公司，杜尔贝科改良伊格尔高糖培养基、澳洲胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒(批号：P0010S)、3-磷酸甘油醛脱氢酶内参抗体(批号：AF1186)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶配置试剂盒(批号：P0012A)均购自上海碧云天公司，磷酸化ERBB3(Tyr1289)抗体(美国Affinity公司生产，批号：DF7597)，磷酸化Akt(Ser473)抗体(批号：4060T)、Akt抗体(批号：4691S)均购自美国Cell Signaling Technology公司，ECL荧光检测试剂(北京索莱宝公司生产，批号：PE0010)。人HER2阳性乳腺癌细胞株BT474-V1、SKBR3-V1，ERBB3基因正常表达的人HER2阳性乳腺癌细胞株BT474-C1、SKBR3-C1，ERBB3基因E928G突变的人HER2阳性乳腺癌细胞株BT474-M1、SKBR3-M1均由中山大学肿瘤医院实验室提供。

1.2.2基因组DNA提取 石蜡包埋组织样本在提取核酸前进行组织脱蜡，新鲜组织样本无需进行此步骤。新鲜组织标本研磨成小颗粒，石蜡包埋组织标本脱蜡后研磨，加入细胞裂解液，充分混匀后加入蛋白酶K，水浴加热至完全溶解，加入核糖核酸酶A，水浴1 h迅速降温，加入蛋白沉淀液离心，取上清液加入异丙醇，离心，弃上清液，加入70%乙醇冲洗DNA沉淀，离心弃去上清液，加入DNA溶解液水浴溶解DNA。样本质量要求核酸总量>50 ng为合格品，DNA纯度A260/A280为1.7～2.1。

1.2.3上机测序及数据分析 引物设置为寡核苷酸，模板为文库片段进行DNA的复制，复制完成后将文库片段洗脱，采用边合成边测序，在Read1完成后，解链并洗掉测序中合成的部分，加入Index引物，继续进行复制，读出接头中Index序列，从而得出每个位点的DNA所属文库。本研究测序范围覆盖520个癌症相关基因的基因组进行分析，对于目的基因ERBB3的检测包括拷贝数变异、基因融合、单核苷酸变异、插入或缺失等。

1.2.4Western blot检测磷酸化Akt水平 采用胰酶分别消化细胞株BT474-V1、SKBR3-V1、BT474-C1、SKBR3-C1、BT474-M1、SKBR3-M1，在培养皿中加入培养基，移液枪吹打成细胞悬液后转移至EP管中，2 500 r/min离心5 min，弃去上清液。磷酸盐缓冲溶液吹打洗涤细胞，继续离心，再重复磷酸盐缓冲溶液洗涤1次。在每管细胞中加入细胞裂解液置于冰上裂解5 min，再将每管置于超声裂解细胞仪继续裂解。取上清液分装于0.5 ml离心管。本实验采用BCA法测蛋白浓度，具体操作流程严格按照试剂盒流程执行并绘制标准曲线图，按照标准曲线计算出待测蛋白浓度。采用凝胶试剂盒操作说明进行凝胶的配置。待测样品中加入Loading buffer混匀后，金属浴100 ℃ 5 min。每孔上样量12 μl后连接电源正负极进行电泳，初始先将电流设置为80 V电泳20 min后，增大电压至120 V继续电泳，总时长为2.5 h。电泳结束后开始电转膜，调整电流至250 mA，电压100～120 V，转膜时间为4 h。转膜结束，加入封闭液室温封闭1 h。一抗按照说明书稀释后，摇床上4 ℃孵育过夜。一抗孵育结束后，在室温下Tris-Hcl缓冲液洗膜3次，再加入与一抗相应的二抗室温孵育1 h。孵育结束后，继续用Tris-Hcl缓冲液洗膜3次。ECL工作液处理后，置于蛋白印迹ECL-过氧化物酶成像分析系统进行扫描拍照。

1.3统计学方法 采用PROVEAN、SIFT及Poly-Phen-2 HumVar生物信息学软件预测点突变对蛋白质改变产生的危害性。PROVEAN软件评分为-14～-2.5定义为有害突变，-2.5～14定义为良性改变；SIFT软件评分>0.05定义为中性，<0.05定义为有害突变；Poly-Phen-2 HumVar软件评分为0～0.446定义为中性，0.910～1.00定义为可能有害[13-14]。

2 结 果

2.1HER家族变异分布情况 384例患者中133例检出HER家族变异(包括表皮生长因子受体1、ERBB2、ERBB3、ERBB4)。表皮生长因子受体1变异频率为1.3%(5/384)；ERBB2变异频率最高，为28.9%(111/384)，其中ERBB2扩增103例，ERBB2突变14例，同一患者的ERBB2基因可同时存在多种变异类型；ERBB3变异频率为3.4%(13/384)；ERBB4变异频率为1.0%(4/384)。

2.2ERBB3基因变异患者的一般情况 13例ERBB3基因患者年龄22～80岁，中位年龄54岁，年龄≥50岁8例，年龄<50岁5例；月经状态：绝经前6例，绝经后7例；病理类型：浸润性导管癌11例，浸润性小叶癌1例，浸润性混合型癌1例；组织学分级：Ⅰ级2例，Ⅱ级5例，Ⅲ级6例；肿瘤大小：T17例，T25例，T31例；淋巴结转移状态：N010例，N11例，N21例，N31例；临床分期： Ⅰ A 5例， Ⅱ A 6例，ⅢA 1例，ⅢC 1例；ER状态：ER+10例，ER-3例；HER2状态：HER2+3例，HER2-10例；HR/HER2状态：HR+/HER2-7例，HR+/HER2+3例，HR-/HER2-3例，无HR-/HER2+患者。

2.3乳腺癌ERBB3基因变异类型 本研究中检测到ERBB3常见的突变类型为错义突变，此外还有扩增、内含子突变。突变的热点主要集中在胞外结构域Ⅱ以及激酶区，突变的热点为V104L、E928G，见图1。13例患者中有12例为ERBB3基因错义突变(其中1例患者ERBB3基因发生G284A、E928G两个位点的错义突变)，1例患者检测到ERBB3基因扩增。在12例基因错义突变患者中，有1例患者检测到ERBB3基因内含子突变。本研究检测到的新突变位点为N522S、S300F、R678W、M760R、Q1301*。

注：Mutations为突变，ERBB3为人表皮生长因子受体3

2.4ERBB3基因突变蛋白功能损伤预测 PROVEAN、SIFT及Poly-Phen-2生物信息学软件预测点突变对蛋白质改变产生的危害性，结果显示，D297Y、T355I、E928G、E1261A、L431F、P583S、R667L、D297H、R678W位点的改变均可能对蛋白质结构或功能造成有害影响，见表1。

2.5Western blot检测磷酸化ERBB3、Akt水平 人HER2阳性乳腺癌细胞BT474-V1、SKBR3-V1均不表达ERBB3蛋白。BT474-C1、SKBR3-C1均为重新构建的能够表达ERBB3蛋白的人HER2阳性乳腺癌细胞。BT474-M1、SKBR-3-M1是慢病毒感染后构建的ERBB3基因E928G突变的人HER2阳性乳腺癌细胞。6组细胞中磷酸化ERBB3水平未见明显改变，在BT474-M1、SKBR-3-M1两组细胞中磷酸化Akt水平明显升高，见图2。

表1 ERBB3突变位点PROVEAN、SIFT、Poly-Phen-2 HumVar软件评分

注：pERBB3为磷酸化人表皮生长因子受体3，pAkt为磷酸化蛋白激酶B,GADPH为3-磷酸甘油醛脱氢酶

3 讨 论

既往研究发现，ERBB3基因扩增可促进肿瘤细胞生长分化，最终导致对药物治疗的敏感性降低[15]。多项研究发现，ERBB3扩增改变或ERBB3与其他HER家族成员形成异二聚化后，不易被降解，下游通路异常激活导致细胞增殖[16-17]，但对于ERBB3基因突变对肿瘤影响的研究较少。Yang等[18]发现ERBB3基因不同位点突变的胃肠道肿瘤对酪氨酸激酶抑制剂的敏感性不同，通过构建不同位点突变的肿瘤细胞发现E928G位点突变对耐药的影响最大，影响药物疗效的机制可能与下游PI3K/Akt信号通路的异常激活相关[7]。ERBB3基因在乳腺癌方面的研究主要是基因扩增对肿瘤的影响，涉及基因突变的研究较少[19-20]，故本研究旨在探索ERBB3突变对乳腺癌治疗的影响。

与以往研究不同，本研究从临床患者样本的数据出发，寻找ERBB3基因常见突变类型及突变热点，主要研究潜在的有害突变位点对乳腺癌细胞功能的影响。本研究结果显示，本中心与TCGA数据库中均存在共同的突变热点E928G及V104L，利用生物信息学软件对检测到的突变位点进行分析，因此能更快地筛选出潜在的有害突变位点。经过3个软件分析显示，E928G位点突变危害性更大，与以往文献报道相同[18]。通过对突变细胞磷酸化Akt水平的检测，验证了ERBB3突变的HER2阳性乳腺癌细胞中磷酸化Akt水平升高，该结果可能与ERBB3基因构象改变相关。E928位点位于激酶区，该区域存在PI3K调节亚基位点，与PI3K相结合后激活下游通路，当E928位点发生改变，募集到更多的PI3K结合亚基位点，下游PI3K/Akt信号通路活化水平提高，可能导致肿瘤细胞发生耐药[21-22]。

综上所述，ERBB3基因E928G突变可引起细胞内磷酸化Akt水平升高，可能使下游PI3K/Akt信号通路过度激活，导致耐药的发生。本研究为HER2阳性乳腺癌患者抗HER2治疗耐药的机制研究提供了新方向，同时也为多靶点联合治疗提供了新思路。但本研究存在的不足主要是未进行临床标本的验证，有待后续的药物相关性研究进行补充。