修天元 彭伟

高血压作为全球罹患人数第一的心脑血管疾病，人们对其认识已逐渐深入到基因层面。在同样的生活条件下，何种群体更易被诱发高血压、其诱发机制又如何，已成为高血压一级预防里最为重要的研究方向。1990年提出了“发育源性的成人健康和疾病”假说，之后大量的实验证明，母代的肥胖状态激活了子代原本被弱化的生存基因，使后代更倾向于表现出节约能量、升高血压[1]。血压中枢敏化指由于在母体受到不良因素的影响，导致子代的中枢系统发生一系列神经重塑，使其在成年后暴露于不良因素时更易发生高血压[2]。本系列研究已证明高脂饮食饲养下的母代可上调子代中枢下丘脑内和升压相关核团的敏感性，无论是正常饮食饲养还是继续给予高脂饮食，子代成年后在升压药物的急、慢性刺激下，较正常饮食母亲的正常饮食后代，均表现出更明显的血压升高状态[3]。本实验将继续探寻高脂饮食母代的雄性子代，在成年后给予不同的危险因素(如高盐饮食)暴露，对比正常饮食的后代血压变化情况。

1 材料与方法

1.1 实验动物 8周龄SPF级SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌性20只，体重(160±10)g，雄性10只，体重(180±10) g，均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物合格证书SCXK-(京)2019-0008，繁殖使用，购进后全部使用正常饲料适应性喂养1周。实验涉及饲料均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证书SCXK-(京)2014-0008。6周龄SD大鼠(雌性20只，雄性10只)购入后全部正常饲料适应性喂养1周，将雌鼠随机分为2组，每组10只，合笼前分别予正常饮食和高脂饮食喂养2周后，雄∶雌采取1∶2循环交配法合笼，正常饮食组(C)孕前4周、孕期和哺乳期均正常饮食，高脂饮食组(H)孕前4周、孕期和哺乳期均高脂饮食。所有子代出生后，将正常饮食组母代(C)的雄性子代随机分为正常饮食组(C/MC)和高盐饮食组(C/MH),将高脂饮食组母代(H)的雄性子代同样随机分为正常饮食组(H/MC)和高盐饮食组(H/MH)，保证4组雄性子代每组≥24只。为了消除哺乳期间每窝幼鼠数量不同导致母鼠喂养带来的体重差异，每窝数量控制在9只左右，所有雌性子代和多余雄性子代均去除。

1.2 药品与试剂

1.2.1 主要试剂：血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，批号：ALX-160-042-M349，购自苏州信达生物科技有限公司；异氟烷，批号：P8410-45，购自德国默克；肝素钠，批号：F20171203，购自天津福晨化学试剂有限公司；地佐辛注射液，批号：H5330205，购石家庄制药有限公司；Trizol Reagent，购自美国 Invitrogen 公司；实时荧光定量所需引物，由赛默飞(中国)有限公司合成；PrimeScript TM RT Master Mix，购自日本 TaKaRa 公司；SYBR®Premix Ex Taq TM Ⅱ，购自中国 TaKaRa 公司；RNeasy® Mini Kit，购自美国 Qiagen公司。

1.2.2 主要仪器：HD-S10动物生理信号无线遥测系统，购自于美国DSI公司；Version Gold 4.0 Dataquest ART ®数据分析系统，提供于美国DSI公司； Chart version 7.2Powerlab 四通道生物机能实验系统，购于美国instrumen公司；M-CENTRIFUGE 小型离心机，美国 AndyBio公司；LE225D 型电子天平(1/100 000)，购于德国赛多利斯股份公司；Mini-osmotic Pump 渗透泵，美国 DURECK 公司；77019 双目万向支架体视显微镜和68001R 脑立体定位仪，均购于深圳瑞沃德生命科技有限公司；1864干燥灭菌器，美国 Cell Point Scientific公司；ABI7300 实时荧光定量 PCR 仪，美国应用生物系统公司；RT-2100C 酶标仪，上海创奕科技设备有限公司；显微手术器械(包括 Vannas 剪(500086)、Dumont镊)，购于美国 WPI；聚氨酯管 PE10、PE50，不锈钢套管，购于美国 Braintree 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 功能试验：4组雄性后代10周龄时进行2个相互独立的功能试验，分别记录子代在不同方式刺激下全身压力反射应答，检测高脂饮食母代是否会使子代暴露在高盐环境下更易出现血压和心率变化。

1.3.1.1 植入脑室套管及急性微量注入AngⅡ的效应：10周龄雄性子代异氟烷吸入麻醉后，使用2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，将PE50导管前端适度拉伸后，植入股动脉，深入长度3～5 cm，插入腹主动脉、肾动脉水平，将导管结扎后，腹内至颈后皮下做隧道，将导管引出至颈后妥善固定，使用肝素盐水封管。同时，使用小动物脑室套管，于右侧脑室置管，坐标为前囟门向右1.5 mm，向后1.0 mm，向下4.5 mm深度，术后至少恢复24 h，建立清醒动物模型。第1天从侧脑室套管微量注射2 μl 0.9%氯化钠溶液，记录心率、血压变化，1 h后予AngⅡ 200 ng经微量注射器行变化侧脑室注射，同样记录压力反射变化，次日倒序进行。为排除侧脑室插管位置异常导致的统计误差，所有试验用鼠最终给药结束后，均经侧脑室置管注入美兰染剂，解剖确定置管所在脑室位置正确后，再将该试验数据纳入最终数据分析，经后期统计该插管准确率≥95%。

1.3.1.2 股动脉安装植入子和外周慢性灌注AngⅡ实验：8周龄雄性子代异氟烷吸入麻醉后，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，通过股动脉安装植入子(DSI)，手术后恢复7 d，开始记录基础血压5 d。根据大鼠体重，配制可缓释2周的AngⅡ(130 ng·kg-1·min-1)装入渗透泵(2002,Alzet)，植入前1 d将装满药物的渗透泵浸入0.9%氯化钠溶液中孵育过夜，以保证渗透泵工作时释放药物状态稳定。次日动物在麻醉状态下，于颈后两肩胛中间前方皮肤做纵行切口将渗透泵植入，灌流AngⅡ 14 d，期间股动脉探针24 h持续采样，设置采样频率为1 000 Hz，每隔1 h采样1次，每次从整点开始记录，每次采样5 min。

1.3.2 压力感受器反射性检测：急性股静脉泵入苯肾上腺素/硝普钠实验：10周龄雄性子代异氟烷吸入麻醉后，使用2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，将PE50导管前端适度拉伸后，分别植入股动脉和股静脉，深入长度3～5 cm，插入腹主动脉、肾动脉水平，将导管结扎后，腹内至颈后皮下做隧道，将导管引出至颈后生物胶固定，使用肝素盐水封管、定时冲管，避免堵塞。皮下注射庆大霉素抗感染和地佐辛止痛，术后动物至少恢复24 h，建立清醒动脉模型，待动物能够自由活动后，股静脉用于给药，股动脉用于连接小动物生命信号采集系统记录给药后生命体征变化。第1天记录5 min基础生命体征后，1 mg/ml苯肾上腺素3 μl/min速度泵入5 min,2 h后给予2 mg/ml浓度硝普钠3 μl/min 泵入，同样记录5 min,次日倒序进行。

1.4 观察指标 (1)母代繁殖能力、子代体重增加差异；(2)子代急性侧脑室给药导致的全身压力应答反应；(3)记录血压波形进行血压变化、心率变异等方面的分析，确定子代雄鼠对慢性灌流AngⅡ诱发高血压的反应性；(4)外周给予肾上腺素/硝普钠后不同子代血压和心率变化的相关性。

2 结果

2.1 母代繁殖能力 正常饮食组与高脂饮食组母代繁殖能力比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 母代繁殖能力 n=20

2.2 子代体重观察 不同饮食母代的幼鼠出生体重间差异无统计学意义(P>0.05),出生后1周开始高脂饮食母代的后代体重比正常饮食组增长快，差异有统计学意义(P<0.05)，该现象持续到离乳后第1周，后子代体重增长程度无差异，直至成年前2周，高脂饮食组子代再次出现较快的体重增长，差异有统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 子代体重观察

2.3 急性侧脑室注射AngⅡ对MAP和HR的影响 脑室给药后正常饮食母代比较高脂饮食母代的后代MAP差异有统计学意义(P<0.01)。各组MAP均有明显上升，H/MH组侧脑室注射AngⅡ后诱发的升压效应巨大(n=6，P<0.05)，该组比较其他3组血压变化差异有统计学意义(P<0.01)，但4组后代间血压变化差异无统计学意义(P>0.05)；对于侧脑室给予AngⅡ后心率均有所下降，高脂饮食母代的后代对比正常饮食母代组后代的心率变异率差异有统计学意义(P<0.05)，4组后代间心率变化差异有统计学意义(P<0.05)，其中H/MH组心率变异率最大(P<0.05)。见表3、4。

表3 急性侧脑室注射AngⅡ后正常饮食和高脂饮食母代的后代△MAP变化

表4 急性侧脑室注射AngⅡ后△HR变化 n=20,次

2.4 慢性灌注AngⅡ对血压的影响 10周龄时高脂饮食母代的雄性子代(n=12)基础血压为(118.57±4.75) mm Hg，基础心率为(349.08±3.37)次/min，较正常饮食母代的雄性子代(n=12)的基础血压(119.93±6.29) mm Hg和基础心率(349.81±3.99)次/min均有轻微升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。在慢性渗透泵给药AngⅡ后，与对照组子代比较，差异有统计学意义(P<0.05)，妊娠期、哺乳期高脂饮食母代的后代均表现出显著增强的血压升高反应(P<0.05)，2组差异有统计学意义(P<0.01)。在AngⅡ开始缓慢释放后，各组子代MAP均有上升，HR均有下降，差异有统计学意义(P<0.01)，其中H/MH组缓慢给药AngⅡ后诱发的升压效应巨大(P<0.05)，心率下降幅度同样巨大，该组比较其他3组血压变化(P<0.01)。见表5～7。

表5 正常饮食组和高脂饮食组雄性子代10周龄基础血压/心率比较

表6 慢性灌流AngⅡ后正常饮食和高脂饮食母代的后代△MAP/△HR变化

2.5 压力反射功能的影响 采用药理学方法研究心脏压力反射功能，通过苯肾上腺素或输注硝普钠期间血压与心率变化相关的回归线斜率来确定的。输注苯肾上腺素(PE)和硝普钠(SNP)后，无论子代是否高盐饮食，高脂饮食母代的后代组血压和心率的变化斜率均小于正常饮食母代组的正常饮食子代(H/MH

表7 4组雄性子代慢性灌流AngⅡ后△MAP和△HR的变化

表8 股静脉注射PE后△MAP和△HR的相关性分析

图1 股静脉注射PE后△MAP和△HR的相关性

表9 股静脉注射SNP后△MAP和△HR的相关性分析

图2 股静脉注射SNP后△MAP和△HR的相关性

3 讨论

本研究中正常饮食母代和高脂饮食母代的子代在出生时体重并无明显差异，但1周后高脂饮食组子代体重明显增加，这种增势一直延续至8周龄成年，郑佳等[4]发现高脂饮食母代的后代出生体重较低，但3周后体重将明显高于正常饮食组子代，这种现象被称为“追赶型生长”，是一种补偿性生长，也是后代成年后体脂更易增多、炎性因子更易释放的基因基础[5]。大量证据表明追赶型生长在子代成年后显著增加胰岛素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病的易感性[6]。由于体重受各种干扰因素较多，将其作为代谢指标的评估过于简单，建议使用腹部脂肪含量(腹型肥胖者更有意义)和血液内瘦素水平进行比较。有研究证实了该论点，同大多数该类实验相同，高脂饮食母代的子代体质量较正常饮食组母代的后代，差异并无统计学意义(P>0.05)，但前者子代存在较典型高瘦素血症，且随着年龄增长持续升高，同时腹部脂肪含量(大网膜脂肪层克数)也明显高于对照组[7-9]。

脂肪细胞可分泌多种激素和炎性因子[10]，AngⅡ是RAS的主要活性成分，脂肪组织可不受循环中RAS活动的影响而单独合成AngⅡ[11,12],该因子是导致肥胖高血压的重要因素，研究表明孕期和/或哺乳期高脂饮食促使脂肪组织合成大量AGT，激活RAS系统，编程子代血压中枢[13]，从而导致子代更易发生高血压。

孕期和哺乳期高脂饮食可敏化雄性子代的高血压相关核团，该系列实验已证实8周龄子代中，高脂饮食母代组的雄性后代较正常饮食对照组脑中RAS系统相关受体、炎性因子活性表达均明显增加，说明高脂饮食组子代在血压升高之前这些基因表达已经上调，该种效应为成年后高血压的发生起到易化作用[14]。前期研究也发现给予母代高脂饮食实现子代血压中枢对AngⅡ的敏感化效应，与其子代PVN和LT中RAS成分的mRNA表达增加有关[7]。

SFO 是 LT 的一个室周器官，缺乏血脑屏障，是中枢神经系统结构中直接感知循环各种信号分子的界面，它与 PVN 间的信号联系是 AngⅡ诱导的交感输出增加型高血压形成的重要路径[15]。PVN 是下丘脑的一个关键核团，分为大细胞区和小细胞区，小细胞区功能为接受来自SFO 关于循环肽的关键信息，例如循环中AngⅡ增加，SFO 神经元的刺激会增加，随后 PVN 神经元发出纤维直接投射到脑干和脊髓调节交感活动[16]。PVN 中已活化的星形胶质细胞可以感知血压升高和高能量摄入等不良刺激，并作出应答，影响交感输出，最终导致神经源性高血压的产生。而星形胶质和小胶质细胞激活后还可导致PVN 中 RAS 成分的mRNA 表达增加，从而引起血压波动和能量代谢失衡[17]。SFO 含有大量的 ACE 和AT1R，均为中枢神经RAS 系统的重要成分，SFO 神经元激活，引起交感神经激活，是心力衰竭和血压升高的生理基础[18]。结合前期研究，可显示高脂饮食导致子代 PVN 中胶质细胞活化，通过相应机制易化神经源性高血压。

本实验急性侧脑室给药作用于下丘脑盐感受器、渗透压感受器和数个参与血压调控的核团，如SFO、PVN和OVLT[19]，注射1 min后，各组子代血压均开始升高，5～10 min左右H/MC和H/MH组引起的变化幅度最大，这个结果与既往研究相符合，说明高脂饮食子代表现出对中枢应激刺激的高反应性[20]。

结合前期试验已证明，高脂饮食的雄性子代，在成年前，中枢神经核团血压调控功能已出现改变，并且这些改变易化了成年暴露于高危因素下发生高血压的倾向，因此可明确SFO成分表达是高血压形成的基因层面的主要机制。本研究可进一步完善原发性高血压的发病机制，为后续治疗手段提供更多的介入点，对于防治两代健康均有积极意义。