王晓元 沈海丽 王鑫 张莉 朱蓉 熊咏民

骨关节炎是一种常见的慢性退行性关节疾病，与软骨及其周围组织有关，临床表现为进行性关节疼痛、僵硬及功能障碍等，长期易导致严重的残疾，给患者生活带来极大不便，严重影响患者身心健康[1]。软骨细胞是关节软骨内的唯一细胞，参与细胞外基质降解、合成过程，其异常会导致外基质稳态失衡，最终导致关节功能丧失[2]。Toll样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)是天然免疫受体，与相应配体作用后，通过激活核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路调控白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8等多种炎性因子的产生与释放[3]。研究表明，TLR4/NF-κB通路在软骨细胞炎症损伤过程中发挥重要作用[4]。唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素9(sialic acid-binding Ig-like lectin 9，Siglec-9)能够调节多种免疫细胞的功能，是炎症相关疾病的重要调控分子，能够通过抑制NF-κB途径减轻肠道炎症[5,6]。但Siglec-9对关节软骨细胞炎症损伤的作用目前尚无相关研究。本研究将通过使用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)诱导关节软骨细胞发生炎症损伤，研究Siglec-9对该过程的影响并探索涉及到的相关机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 人关节软骨细胞(货号：CP-H096)购自武汉益普生物科技有限公司；DMEM-F12培养基(货号：DXT-C11330500BT)购自美国invitrogen公司；胎牛血清(货号：FBS500-S)购自澳大利亚AusGeneX公司；TNF-α(货号：CYT-252)购自以色列prospec公司；Siglec-9(货号：ATMP01933HU)购自武汉益普生物科技有限公司；MTT溶液(货号：N/A-896)购自美国AMEKO公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(货号：S0185)购自哈尔滨新海基因检测有限公司；人IL-1β、IL-6和IL-8酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(货号：YJ401158、YJ401120、YJ1012241)购自上海一基实业有限公司；TLR4抗体、NF-κB p65抗体、p-NF-κB p65抗体、核因子κB抑制蛋白α(nuclear factor kappa B inhibitor protein alpha，IκB-α)抗体、p-IκB-α抗体、GAPDH抗体(货号：ab13556、ab140751、ab194726、ab95338、ab92700、ab181602)购自abcam公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔(货号：0295G-HRP)购自美国santa公司；恒温培养箱(型号：TY10GI2-2)购自美国Shellab公司；酶标仪(型号：Stat Fax-2100)购自美国Awareness公司；流式细胞仪(型号：BD FACSCanto II)购自美国BD公司；化学发光成像系统(型号：MG8000)购自美国Thmorgan公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:将人关节软骨细胞接种于含5%胎牛血清的DMEM-F12培养基中，置于5℃、5% CO2培养箱中进行培养、传代。

1.2.2 MTT法检测软骨细胞活性:用DMEM-F12培养基将软骨细胞配制成1×105个/ml的单细胞悬液，以每孔100 μl接种于96孔板，分为对照组、TNF-α组、低浓度Siglec-9组、中浓度Siglec-9组和高浓度Siglec-9组。对照组不添加药物处理，TNF-α组添加终浓度为20 ng/ml的TNF-α，低、中、高浓度Siglec-9组添加终浓度为20 ng/ml的TNF-α及终浓度分别为2、10和50 ng/ml的Siglec-9。孵育48 h，弃上清，每孔加MTT溶液100 μl，继续孵育4 h，每孔加DMSO 150 μl， 震荡10 min充分溶解结晶，使用酶标仪于波长570 nm处检测各孔吸光度(optical density，OD)值，计算细胞存活率(%)。细胞存活率=OD给药组/OD对照组×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测软骨细胞凋亡情况:用DMEM-F12培养基将软骨细胞配制成1×105个/ml的单细胞悬液，以每孔100 μl接种于96孔板，按照1.2.2步骤进行分组处理，培养48 h，收集细胞，使用1×结合缓冲液将细胞浓度调整为1×106个/ml，取100 μl细胞悬液于离心管中，加入Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl 混匀，避光孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4 ELISA法检测软骨细胞上清液中炎性因子水平:用DMEM-F12培养基将软骨细胞配制成1×105个/ml的单细胞悬液，以每孔100 μl接种于96孔板，按照1.2.2进行分组处理，培养48 h，离心收集上清液，分别按照IL-1β、IL-6和IL-8 ELISA试剂盒说明书进行操作，使用酶标仪检测450 nm波长处的各孔OD值，计算IL-1β、IL-6和IL-8水平。

1.2.5 蛋白印迹(western blot，WB)法检测软骨细胞中TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达情况:用DMEM-F12培养基将软骨细胞配制成1×105个/ml的单细胞悬液，以每孔200 μl接种于6孔板，按照1.2.2部分进行分组处理，培养48 h，收集细胞，用蛋白裂解液裂解，离心取上清，BCA法定量，SDS-PAGE电泳分离蛋白质，并转至PVDF膜上，室温下5%脱脂奶粉封闭1 h，加入TLR4抗体(1∶1 000)、p-NF-κB p65抗体(1∶500)、NF-κB p65抗体(1∶500)、p-IκB-α抗体(1∶200)、IκB-α抗体(1∶200)、GAPDH抗体(1∶1 000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜，加羊抗兔二抗(使用辣根过氧化物酶标记，1∶2 000)，室温孵育30 min，化学发光法显色，使用凝胶成像仪曝光拍照，分析条带灰度，计算相对表达量。

2 结果

2.1 5组软骨细胞活性 与对照组相比，TNF-α组软骨细胞存活率显著降低(P<0.05)；与TNF-α组相比，低、中、高浓度Siglec-9组软骨细胞存活率显著升高(P<0.05)；随着Siglec-9处理浓度的升高，软骨细胞存活率显著升高(P<0.05)。见表1。

2.2 5组软骨细胞凋亡情况 与对照组相比，TNF-α组软骨细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与TNF-α组相比，低、中、高浓度Siglec-9组软骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；随着Siglec-9处理浓度的升高，软骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。见图1，表2。

表1 5组软骨细胞存活率比较

对照组TNF-α组低浓度Siglec-9组中浓度Siglec-9组高浓度Siglec-9组

表2 5组软骨细胞凋亡率比较

2.3 5组软骨细胞上清液中炎性因子水平 与对照组相比，TNF-α组软骨细胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-8水平显著升高(P<0.05)；与TNF-α组相比，低、中、高浓度Siglec-9组软骨细胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-8水平显著降低(P<0.05)；随着Siglec-9处理浓度的升高，软骨细胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-8水平显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 5组软骨细胞上清液中IL-1β、IL-6和IL-8水平比较

2.4 5组软骨细胞中TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达情况 与对照组相比，TNF-α组软骨细胞中TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκB-α/IκB-α蛋白表达水平显著升高(P<0.05)；与TNF-α组相比，低、中、高浓度Siglec-9组软骨细胞中TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκB-α/IκB-α蛋白表达水平显著降低(P<0.05)；随着Siglec-9处理浓度的升高，软骨细胞中TLR4、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκB-α/IκB-α蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表4。

表4 5组软骨细胞中TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达水平比较

3 讨论

软骨退变是骨关节炎的主要病理变化之一，而软骨细胞是软骨内唯一的细胞，在维持软骨完整性及软骨负重功能方面发挥重要作用[7]。在骨关节炎发病过程中，炎性因子可促使关节软骨细胞凋亡，周围组织纤维化[8]。因此，通过有效抑制炎性反应对软骨细胞的凋亡作用，或成为治疗骨关节炎的有效途径。

TNF-α是骨关节炎进程的关键炎性细胞因子[9]，本研究使用TNF-α诱导软骨细胞，结果显示，软骨细胞的存活率降低，凋亡率升高，同时细胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-6和IL-8水平升高，可用于模拟骨关节炎中软骨细胞生存环境。Siglecs是一类经典的免疫球蛋白样凝集素，能够介导细胞与病原体之间，或细胞与细胞之间的相互作用，在免疫中发挥重要调控作用，广泛参与炎症性疾病、机体自身免疫性疾病及肿瘤等疾病的发生发展过程[10]。Siglec-9是主要表达于单核细胞、中性粒细胞表面的Siglecs家族成员，在小鼠上又被称为Siglec-E。有研究表明，在大鼠脊髓损伤模型中，Siglec-9能够抑制巨噬细胞由促炎型M1细胞向抗炎型M2细胞极化，从而抑制炎性反应强度[11]。而Kano等[12]称，Siglec-9能够诱导M2巨噬细胞的局部浸润，发挥抗炎和促进组织修复作用。近年来，Matsumoto等[13]研究发现，可溶性Siglec-9在胶原诱导的小鼠关节炎模型中发挥抑制作用，可显著抑制关节炎发生率，降低关节炎小鼠临床和组织学病变程度，同时降低血清促炎因子TNF-α浓度。本研究使用低、中、高浓度Siglec-9作用于TNF-α诱导的软骨细胞，结果显示，软骨细胞凋亡率及细胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-6和IL-8水平较TNF-α组显著降低，细胞存活率显著升高，且变化随Siglec-9浓度的升高而加剧，提示Siglec-9可影响炎性反应程度，减轻软骨细胞炎症损伤，促进细胞增殖并抑制细胞凋亡。

TLR4/NF-κB信号通路是常见的炎症通路之一。TLR4属于跨膜受体，能够识别病原相关分子模式及受体复合物，激活信号转导途径，诱发炎性因子表达，引发炎性反应[14]。NF-κB处于TLR4信号通路下游，未受到刺激时以非活化形式与IκB-α结合形成复合物，当促炎因子刺激细胞后，IκB-α发生磷酸化、泛素化继而水解，NF-κB释放并活化调控下游通路，激活炎症级联反应，诱导细胞凋亡[15]。范忠诚等[16]研究表明，水通道蛋白4基因表达可通过抑制NF-κB信号通路促进兔软骨细胞活力、抑制凋亡，对TNF-α诱导的软骨细胞损伤起保护作用。Ding等[17]研究表明，MicroRNA-93通过靶向TLR4/NF-κB信号通路，对骨关节炎中软骨细胞凋亡和炎性反应起抑制作用。本研究结果显示，TNF-α诱导软骨细胞后，细胞中TLR4、NF-κB p65磷酸化、IκB-α磷酸化蛋白水平均显著升高，提示TLR4/NF-κB通路参与TNF-α诱导软骨细胞产生的炎性反应。使用低、中、高浓度Siglec-9处理后，细胞中TLR4、NF-κB p65磷酸化、IκB-α磷酸化蛋白水平较TNF-α组显著降低，提示Siglec-9可能通过阻断TLR4/NF-κB通路降低炎性因子水平，减轻TNF-α诱导软骨细胞产生的炎性反应，减少细胞凋亡，提高细胞存活率。

综上所述，Siglec-9对TNF-α诱导的关节软骨细胞凋亡及TLR4/NF-κB通路激活具有抑制作用，并可提高细胞存活率，可能为骨关节炎治疗提供新的潜力药物，后期将寻找更多的角度探究Siglec-9对骨关节炎的治疗作用及机制。