何静怡，杨梅，林佳，梁安文，李广宏，王方海

有害生物控制与资源利用国家重点实验室/中山大学生命科学学院，广东 广州 510275

水稻是我国重要粮食作物，而白背飞虱是危害水稻的主要害虫之一。白背飞虱（Sogatella furcifera）属昆虫纲（Insecta），半翅目（Hemiptera），飞虱科（Delphacidae）［1］。雄性成虫黑褐色，雌性成虫黄褐色，因其前胸背板和中胸背板呈白色而得名［2］。白背飞虱生活周期包括卵期、若虫期和成虫期，成虫有长翅和短翅两种翅型［3］。长翅型成虫擅长迁飞，可以逃避恶劣的环境；短翅型雌虫多为留居型，具有较高的繁殖力，其产卵量是长翅雌虫的2～4倍［4］。长、短翅型的比例是预测飞虱危害的重要参数［5-6］。

表观遗传是在基因组DNA 没有改变的前提下，通过化学修饰影响基因表达，从而造成表型变化，可以稳定遗传给后代。表观遗传参与生物体多种重要的生命活动，也是生物体应对外界胁迫和环境变化的重要机制［7］。DNA 甲基化是指在DNA 甲基转移酶（DNMTs，DNA methyltransferases）的催化下，给DNA 添加甲基修饰的过程，是一种重要的表观遗传修饰［8］。根据结构和功能的不同可将DNMTs 分为DNMT1、DNMT2 和DNMT3。DNMT1主要负责在半保留复制中，以亲代甲基化位点为模板，催化子链甲基化。虽然传统概念认为DNMT1只有维持甲基化功能，但近年来研究表明，DNMT1 在DNA 从头甲基化中同样起着非常重要的作用［9-10］。DNMT2 主要催化tRNA 甲基化，但不具备催化CpG 岛甲基化的特性［11］。DNMT3 是从头甲基化转移酶，负责在细胞分裂初期催化未甲基化的DNA生成新的甲基化位点［12］。

在昆虫中，通常都存在DNMT1 和DNMT2；而DNMT3 仅在少数昆虫（如膜翅目昆虫） 中被发现［12-13］。

我们研究发现，飞虱雌性和雄性成虫体内的基因组甲基化式样和水平存在明显差异，同时发现在不同翅型个体中的基因组甲基化式样和水平也存在明显差异［14-17］。而DNMT1 是导致基因组甲基化式样和水平发生变化的关键因子之一，故DNMT1 基因在白背飞虱性二型和翅二型分化过程中应发挥着一定的调控作用。

本研究通过建立白背飞虱转录组数据库，结合已经公开发表的白背飞虱基因组数据库，利用生物信息学的方法首先重点阐明白背飞虱DNMT1基因的结构特点，然后利用荧光定量PCR 具体测定了DNMT1 基因在雌雄成虫个体中的头、胸、腹等部位的表达。该研究将增进对稻飞虱DNMTs 的具体结构和生物学功能的认识，并为探索新的防治稻飞虱的方法或途径提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

白背飞虱采自华南农业大学试验田，在实验室已连续饲养多代，饲养条件：温度（28±2）℃、相对湿度70%、光周期为16 h 光照：8 h 黑暗。选取羽化后24 h 内的雌雄成虫各10 头，冷冻后用刀片将虫体头、胸、腹3 部分分离，并分别收集头、胸、腹3部分作为待检测样品。

本实验室已测得白背飞虱转录组数据。根据注释，在转录组数据中找到包含有白背飞虱DNMT1 基因的序列片段，序列号为c88319.graph_c0，片段长度为4 524 bp。GenBank 登录号为MW291509。白背飞虱基因组序列来自NCBI 的Genome数据库（ID 18187）。

1.2 开放阅读框分析

使用NCBI 的ORFfinder （https：//www. ncbi.nlm. nih. gov/orffinder/）对白背飞虱DNMT1 基因的开放阅读框序列进行分析。

1.3 同源序列验证

使用NCBI 的在线BLAST 工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行白背飞虱DNMT1的同源序列寻找，并使用DNAMAN 软件构建系统发育树，建树的物种序列信息均来自NCBI。

1.4 保守结构域预测

使用NCBI 的保守结构域数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）对白背飞虱DNMT1基因进行结构预测。

1.5 外显子和内含子的分布

将白背飞虱DNMT1 基因的开放阅读框与白背飞虱全基因组序列进行比对分析。能比对上的序列是白背飞虱DNMT1 基因的外显子，位于外显子中间的非编码基因序列则是白背飞虱DNMT1 基因的内含子。

1.6 蛋白质的理化性质分析

在ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam.html）上对白背飞虱DNMT1 蛋白的理化性质进行分析。

1.7 蛋白糖基化位点分析

应用NetNGlyc （http：//www. cbs. dtu. dk/services/NetNGlyc/）软件分析蛋白N 型糖基化位点。应用YinOYang （http：//www. cbs. dtu. dk/services/YinOYang/）软件分析蛋白O型糖基化位点。

1.8 实时荧光定量PCR

首先用Trizol（Invitrogen，美国）抽提法从白背飞虱各样品中提取总RNA，然后按照反转录试剂盒PrimeScript™RT Master Mix（TaKaRa，日本）的操作说明将得到的总RNA 反转录合成cDNA，接着使用软件Primer Premier 6.0 设计出DNMT1 基因的引物为（F：ACGCCCAAGACGACAACT；R：CATGACAATGCCGACCAG）。内参基因为Alpha 1-tubulin（NCBI 登录号为KP735521），qRT-PCR 实验采用SYBR green 法，3 次重复。实验结果使用2-△△Ct法进行处理，SPSS 20.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 白背飞虱DNMT1基因的开放阅读框分析

对包含白背飞虱DNMT1 基因的测序片段c88319. graph_c0 进行开放阅读框在线分析。结果表明，位于序列首端的ATG 和序列尾端的TGA 组成了最大的开放阅读框（图1）。说明c88319.graph_c0 的全长即为白背飞虱DNMT1 基因的开放阅读框，长度为4 524 bp，编码由1 507 个氨基酸组成的蛋白质。

图1 转录组片段c88319.graph_c0的开放阅读框Fig.1 The open reading frame of c88319.graph_c0

2.2 同源序列验证

将白背飞虱DNMT1 基因的开放阅读框序列通过NCBI 的在线BLAST 进行同源序列寻找，发现该序列与多种生物的DNMT1 基因高度同源，和褐飞虱的同源性最大。这进一步验证了我们所获得的白背飞虱DNMT1基因的开放阅读框序列是正确的。

利用NCBI 获取不同昆虫的DNMT1 蛋白序列（表1），用DNAMAN 进行同源度分析，白背飞虱与褐飞虱（Nilaparvata lugens）、茶翅蝽（Halyomorpha halys）、意大利蜜蜂（Apis mellifera）、收获蚁（Pogonomyrmex barbatus）、红火蚁（Solenopsis invicta）、小菜蛾（Plutella xylostella）、家蚕（Bombyx mori）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum）、丽蝇蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）的蛋白序列同源度分别为83.65%、53.02%、50.56%、46.35%、46.12%、42.96%、42.72%、35.67%和28.75%。将以上不同物种构建进化树（图2），从图2 中可以看到DNMT1 在各种昆虫之间高度保守，白背飞虱的DNMT1 和褐飞虱的亲缘关系最近，并与同为半翅目的茶翅蝽聚为一支，但与鳞翅目和鞘翅目的亲缘关系则相对较远。

图2 白背飞虱DNMT1系统发育树分析Fig.2 Phylogenetic analysis of DNMT1 of Sogatella furcifera and other homologous sequences from insects

表1 不同物种DNMT1的氨基酸登录号Table 1 Amino acid accession numbers of DNMT1 in different species

2.3 保守结构域分析

使用NCBI 的保守结构域数据库对白背飞虱DNMT1 基因进行结构预测。结果如图3 所示，白背飞虱DNMT1的结构具有典型的DNMT1特征，包括一个DNMT1 相关蛋白结合结构域（DMAP binding domain）、一个复制灶靶向序列（RFTs，replication foci targeting sequence）、一个富含半胱氨酸的锌指结构域（CXXC zinc finger domain）、聚溴同源结构域（PBHD，polybromo homology domain）和一个催化结构域（dcm domain）。

图3 白背飞虱DNMT1的保守结构域Fig.3 The conserved domains of DNMT1 gene of Sogatella furcifera

2.4 外显子和内含子的分布

将白背飞虱DNMT1 基因的开放阅读框与白背飞虱全基因组序列进行比对分析，发现白背飞虱DNMT1 基因位于白背飞虱第3 号染色体上。白背飞虱3 号染色体（CM025292.1）全长67 498 134 bp，而白背飞虱DNMT1 基因位于3 号染色体的第53 720 184 ～ 53 742 750 bp 处（图4），是断裂基因，被许多非编码区域序列隔开，基因全长为22 567 bp，含有18 个外显子（长度分别为55、156、140、351、226、123、249、200、141、194、141、465、214、78、92、139、236、1 696 bp）和17 个内含子（长度分别为73、2833、642、508、631、443、675、805、122、805、1 179、1 608、343、711、2 977、613、2 043 bp）（图5）。外显子在图中用阿拉伯数字1～18标注，内含子在图中用大写字母A～Q标注。

图4 DNMT1基因在白背飞虱3号染色体上的位置Fig.4 The location of DNMT1 gene on chromosome 3 of Sogatella furcifera

图5 白背飞虱DNMT1基因的外显子和内含子分布Fig.5 Exons and introns of DNMT1 gene of Sogatella furcifera

2.5 白背飞虱DNMT1蛋白质的理化性质分析

白 背 飞 虱 DNMT1 蛋 白 分 子 式 为C7466H11720N2098O2317S82，相对分子质量为170 572.77，其中丝氨酸含量最高，占序列的7.8%。蛋白理论等电点为6.15，属于负电性的酸类有212个，阳性碱类的有196个，所以蛋白基本上可以被认为是酸类蛋白。其网织红细胞存在时间大约几十小时。

2.6 DNMT1在雌雄成虫中的表达

我们分别检测了DNMT1 在雌雄成虫身体各部位的表达，发现DNMT1 主要在腹部表达，其次胸部、头部表达量很低。同时发现雌虫中的整体表达量明显高于雄虫，高达4.3倍（图6）。

图6 DNMT1在白背飞虱雌雄成虫中的表达Fig.6 DNMT1 expression in male and female adults

3 讨 论

本文通过在白背飞虱转录组数据中找到白背飞虱DNMT1 的cDNA 序列，并通过NCBI 的ORF finder 网站对序列进行开放阅读框在线分析，得到了全长4 524 bp的开放阅读框序列，该序列编码由1 507个氨基酸组成的蛋白质，具有DNMT1的典型结构：位于N端的DNMT相关蛋白结合结构域，复制灶靶向序列，富含半胱氨酸的锌指结构域，聚溴同源结构域，以及位于C端的催化结构域。再将开放阅读框序列同白背飞虱全基因组序列进行比对，发现DNMT1 基因位于白背飞虱第3 号染色体上，长度为22 567 bp，含有18 个外显子和17 个内含子。这是首次有关白背飞虱DNMT1 基因结构的详细报道，为该基因进一步的体外表达和功能研究打下了基础，有利于探索该酶在稻飞虱生长发育中的具体调控作用，丰富昆虫DNA 甲基化现象的研究。

已经观察到昆虫与人类DNMT1 基因存在C 端结构保守、N端结构不同的特点［18-19］，比如家蚕和蜜蜂DNMT1缺乏DMAP1结合位点、增殖细胞核抗原（PCNA，proliferating cell nuclear antigen）结合结构域和核定位序列，金小蜂DNMT1c以及豌豆蚜的DNMT1a 和DNMT1b 中缺少锌离子结合域［12-13］。我们对于白背飞虱DNMT1 基因的研究也证明了这一结论，与人类DNMT1相比，白背飞虱DNMT1缺乏PCNA 结合位点和核定位序列，说明DNMT1 在昆虫中的作用模式可能与人类中的作用模式有所不同。

DNMT1 在雌成虫中的整体表达量明显高于雄成虫，达4.3 倍，推测雌成虫的基因组DNA 甲基化率应该高于雄成虫。而之前的全基因组的DNA甲基化分析发现白背飞虱雌成虫的全甲基化率（fully-methylated ratio）为7.64%，高于雄成虫的6.88%［16］，与我们的分析结果基本一致。