仇薪鑫，贾燕青，张振仓，杨增岐

(1.杨凌职业技术学院动物工程学院/动物疫病防控陕西省高校工程研究中心，陕西杨凌 712100； 2.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；3.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种急性、接触性、传染性疾病，呈现高病死率，在世界范围内给养禽业带来严重威胁，我国将新城疫列为一类动物疫病[1-2]。NDV感染宿主范围较广，病毒基因型及毒力差异较大，给防控造成了巨大困扰。建立一种能够快速、准确检测NDV强、弱毒株的方法对新城疫防控很重要。随着ND发病情况和流行态势复杂变化，血清学方法不能很好区分新城疫强、弱毒单一感染或混合感染，而其他毒力测定试验，如鸡胚平均死亡时间、1日龄鸡脑内接种致病指数和6周龄鸡静脉接种致病指数耗时费力。RT-PCR检测方法虽然能够在临床上快速检测NDV，但一步法鉴别检测NDV强弱毒株的报道较少[3-4]。

本试验基于前期对NDV各基因的研究发现，不同毒株V蛋白在序列上存在差异，V蛋白拮抗干扰素(IFN)活性的能力可能存在病毒宿主来源差异，而且强毒株V蛋白的IFN拮抗能力强于弱毒株，不同病毒分离株的V蛋白编码基因对病毒致病性的影响存在差异[5]。为了满足生产上对NDV快速高效鉴别检测的需要，本研究基于V蛋白编码基因建立了一种快速鉴别NDV强弱毒株的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 NDV标准强毒株F48E9、弱毒株La Sota(疫苗)、中强毒毒株Blackbird/China/08、弱毒毒株Spotted-necked dove/China/08，传染性法氏囊病病毒(Infections bursal disease virus,IBDV)、传染性支气管炎病毒 (Infectious bronchitis virus,IBV)、传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV) 均由西北农林科技大学禽病研究室保存并提供。

1.1.2 试剂 500 mL/L甘油PBS、青霉素、链霉素；Trizol、氯仿、异丙醇、750 mL/L乙醇；反转录试剂盒，北京全式金生物公司产品。

1.1.3 仪器 微量移液枪，德国Eppendorf公司产品；PCR扩增仪，美国RTC-100公司产品；高速离心机，上海安亭科学仪器厂产品；核酸蛋白测定仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖 所有新城疫病毒均无菌接种至9日龄SPF鸡胚尿囊腔，置37℃恒温培养箱进行培养，弃去24 h内死亡的胚体，无菌收集24 h后死亡鸡胚的尿囊液，置于-80℃保存。

1.2.2 引物设计 根据NCBI数据库，比对新城疫病毒的V蛋白编码基因氨基酸序列，用Primer 5.0软件设计2对引物(表1)，序列中Y为C或T。实现一步法快速检测NDV，并可区分强、弱毒株。

1.2.3 RNA提取 将样品拭子涡旋振荡1 min，充分挤出液体，弃去拭子；吸取300 μL加700 μL Trizol，剧烈振荡2 min，静止10 min。加入250 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上层液体400 μL转入新的无RNA酶灭菌离心管；加入等体积异丙醇，置-20℃沉淀30 min以上，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃去上清，加入1 ml DEPC处理的750 mL/L乙醇，轻轻晃动，4℃、8 000 r/min离心5 min。弃去液体，自然晾干沉淀，用30 μL RNase-free water溶解，用于反转录或保存于-80℃。

表1 检测引物

1.2.4 RT-PCR方法的建立 经对RT-PCR反应体系、反应条件及退火温度进行优化，最终确定RT-PCR反应体系为：2×One-Step Reaction Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNA 1 μL，TransScript®One-Step Enzyme Mix 0.5 μL，RNase-free water 7.5 μL；扩增条件：45℃ 20 min；94℃ 5 min；94℃ 30 s，48℃ 30 s，72℃ 40 s，30个循环；72℃延伸5 min；PCR产物经10 g/L的琼脂糖电泳检测。

1.2.5 特异性与敏感性试验 用建立的RT-PCR方法分别对IBDV、IBV、ILTV等核酸提取物进行扩增，检测引物的特异性。对NDV强、弱毒株RNA，将其含量统一稀释至10 ng/μL后，进行6倍倍比稀释(100～10-6)，每个稀释度分别取1 μL稀释液作为模板，进行敏感性测试。

1.2.6 验证性试验 用建立的检测方法对本实验室前期从临床分离的2株新城疫病毒(中强毒毒株Blackbird/China/08和弱毒毒株Spotted-necked dove/China/08)进行检测。分别取新城疫F48E9毒株、LaSota毒株、临床样本毒株，重复检验3次，检测该方法的稳定性。

2 结果

2.1 建立可区分NDV强、弱毒的RT-PCR鉴别检测方法

根据已知NDV V蛋白编码基因序列设计F0、R0、F1、R1 4条引物，其中F0、R0为通用检测引物，F1、R1用于扩增NDV强毒株特异性片段，2对引物同时用于鉴别NDV强、弱毒株。结果表明，F0和R0 2条引物可以扩增出703 bp的目的条带，F1和R1 2条引物可扩增出456 bp的目的片段。用设计的2对引物可用于鉴定和区分NDV强、弱毒株(图1)，强毒株出现 2个目的条带，分别是703 bp和456 bp，弱毒株只出现 1个703 bp的目的条带。

M.DNA标准DL 2 000；-.阴性对照；1.F48E9；2.LaSota

2.2 特异性试验

以NDV毒株F48E9、La Sota、Blackbird/China/08、Spotted-necked dove/China/08为模板，均可扩增出特异性的目的片段(图2、图3)，而以IBDV、IBV、ILTV等为模板，均未扩增出相应条带，阴性对照也未出现相应条带，表明建立的RT-PCR方法特异性较好。

M.DNA标准DL 5 000；-.阴性对照；1.LaSota；2.F48E9；3.Blackbird/China/08；4.Spotted-necked dove/China/08；5.IBDV；6.IBV；7.ILTV

2.3 敏感性试验

提取的NDV F48E9株、La Sota株的RNA浓度依次为152.6 ng/μL、196.1 ng/μL，将其含量统一稀释至10 ng后，分别按照6倍倍比稀释后(100～10-6)，作为模板进行检测。结果显示，以F48E9毒株为模板，6倍倍比稀释后，与国标通用引物(535 bp)对比，设计的引物(F0、R0)对NDV最小检出量为0.01 ng/μL，国标通用引物最小检出量为0.1 ng/μL；本方法区分NDV强毒株、弱毒株RNA最小检出量均为0.01 ng/μL(图4、图5)。

2.4 验证性试验

经加入2个临床样本毒株验证，本方法可准确检测和区分新城疫病毒强、弱毒株，对每份样品重复3次检测，结果一致，说明建立的检测方法具有可重复性(图6)。

M.DNA标准DL 2 000 ；-.阴性对照；1.F48E9；2.LaSota；3.Spotted-necked dove/China/08；4.Blackbird/China/08；5.IBDV；6.IBV；7.ILTV

M.DNA标准DL 5 000 ；-.阴性对照；1～7.F48E9，100～10-6 M.DNA Maker DL 5 000 ；-.Negative control；1-7.F48E9，100-10-6

M.DNA标准DL 2 000；-.阴性对照；L.LaSota；F.F48E9；1～7.10-0～10-6 M.DNA Maker DL 2 000；-.Negative control；L.LaSota；F.F48E9；1-7.10-0-10-6

M.DNA标准DL 2 000；-.阴性对照；1.LaSota；2.F48E9；3.Blackbird/China/08；4.Spotted-necked dove/China/08

3 讨论

本研究用P基因编辑产生的V蛋白设计一步法快速检测和区分强、弱毒株的方法[5]。设计的第1对引物(F0、R0)能够准确检测出新城疫病毒，目的片段为703 bp，可作为通用引物用于NDV不同毒株的检测，而第2对引物(F1、R1)只能在强毒中扩增出456 bp大小的特异性条带。因此，用2对引物可以同时实现对NDV的检测及强、弱毒的区分，强毒株可扩增出2个目的条带(703 bp、456 bp)，而弱毒株只显示1个目的条带(456 bp)。用所建立的方法同时检测F48E9、La Sota、IBDV、IBV和ILTV，发现IBDV、IBV和ILTV均为阴性，证明本方法可用于NDV和临床常见家禽呼吸性病毒病的鉴别诊断。对不同稀释倍数的RNA模板进行检测发现，引物(F0、R0)对NDV最小检出量0.01 ng/μL，明显高于国标通用引物最小检出量(0.1 ng/μL)，引物(F1、R1)区分NDV强毒株、弱毒株RNA最小检出量均为0.01 ng/μL，表明本检测方法具有较高的敏感性。用实验室前期分离的2株临床毒株做验证性试验，发现本方法可准确检测和区分新城疫病毒强、弱毒株，并具有可重复性。

NDV逃避宿主免疫，突破宿主机体的天然免疫屏障，主要利用P基因编辑产生的V和W蛋白进行调控，V 蛋白在干扰素拮抗、致病性和宿主嗜性等方面具有重要作用[6-10]。本研究基于V蛋白编码基因建立的一步法RT-PCR检测方法可用于新城疫强、弱毒株的快速鉴别检测，对新城疫不同毒株致病性差异研究和临床诊断均有应用价值。