欧阳艳，周艳荣，方六荣*，肖少波

(1.华中农业大学动物医学院/农业微生物国家重点实验室，湖北武汉 430070；2.湖北三峡职业技术学院，湖北宜昌 443000)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以仔猪的呼吸道症状和妊娠母猪的繁殖障碍为主要特征的一种烈性传染病[1-4]。该病最早在美国发现，我国于1996年首次分离到PRRSV后，该病就在我国广泛流行并给养猪业带来了很大损失[5-7]。高度的遗传变异是PRRSV的一个重要特征，其中ORF5(GP5)和Nsp2因高变异性常被用于系统发育和进化分析[4-6]。为了更好地监测PRRSV在中国的流行状况及遗传变异，本研究对采自中国主要生猪养殖区疑似PRRSV感染的309份猪肺脏组织样品进行检测，并对ORF5基因进行测序分析，掌握PRRSV的流行情况和遗传变异规律，以期为PRRS的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 2017年-2018年，采集中国主要生猪养殖区河南、湖北等16省份疑似发病猪肺脏组织样品共309份。

1.1.2 主要试剂 RNA PCRTM(AMV)试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒、Premix ExTaqTM试剂和pGEM-T-Easy克隆载体，宝生物工程(大连)有限公司产品；DNA Marker，武汉擎科生物工程有限公司产品；Trizol总RNA提取试剂盒，Omega公司产品。

1.1.3 仪器设备 组织破碎仪(Thermo)和涡旋振荡仪，Thermo公司产品；冷冻高速离心机，Eppendorf centrifuge公司产品；电泳仪及电泳槽和PCR仪S1000，Bio-Rad公司产品，制冰机，SANYO公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料处理 无菌操作取病料，加灭菌PBS充分研磨，制成组织悬液，取上清液用于RNA提取。

1.2.2 引物设计与合成 参照PRRSV VR-2332全长基因组序列，设计1对专用引物扩增Nsp2基因序列的高度可变区(Classical PRRSVs扩增1 072 bp,HP-PRRSVs扩增985 bp,NADC30-like PRRSVs扩增682 bp)和1对通用引物检测并扩增完整的ORF5基因序列(表1)。

1.2.3 RNA提取与PRRSV RT-PCR检测 按照病毒核酸步骤提取病毒总RNA，再用Takara反转录试剂盒进行反转录。PCR反应体系25 μL：2×PCR easyTaqmix 10.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA样品1 μL，无RNA 酶水10.5 μL。PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环；再72℃延伸10 min。反应结束，取8 μL PCR产物，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳，结束后在凝胶系统成像仪下观察结果。

表1 本研究使用的引物

1.2.4 PRRSV ORF5基因的扩增与测序 使用ORF5引物扩增ORF5基因的全长序列，PCR产物纯化后克隆于pGEM-Teasy载体，再转入大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，用PCR扩增验证阳性克隆，验证成功后提取质粒，再将酶切鉴定正确的质粒送武汉擎科生物工程有限公司进行序列测定。

1.2.5 PRRSV ORF5基因遗传进化分析 用MAFFT软件对测序获得的53个ORF5基因序列与GenBank已公布的常用参考毒株序列进行比对分析，用Mega-X软件根据Neighbor-Joining运算法绘制遗传进化树，进化分析所用参考毒株的背景信息见表2。

表2 参考毒株信息

2 结果

2.1 临床样品PRRSV RT-PCR检测结果

PRRSV阳性率38.51%，其中HP-PRRSV毒株91份，占总阳性样品数的76.5%；NADC30-like毒株28份，占总阳性样品数的23.5%(表3)。另外，在检测中也发现HP-PRRSV和NADC30-like两种毒株共同感染的样品3份，2份来自广州，1份来自湖北。

2.2 PRRSV ORF5基因同源性分析

所测得的53株GP5的氨基酸相似性为87.1%～100%，与北美型毒株VR-2332的氨基酸相似性为79.9%～96.6%，与HP-PRRSV代表株JXA1的氨基酸相似性为79.9%～96.6%，与类NADC30毒株代表株HENAN-XINX的氨基酸相似性为80.5%～93.3%。所测的这些序列在这3类亚型中都有分布。

2.3 PRRSV ORF5氨基酸序列的系统进化树

所测得的53株PRRSV毒株均为美洲型毒株，美洲型PRRSV被分为9个lineage(亚系)，此次测得的53株分别从属于lineage 1、3、5、8(图1)。

1.DNA标准DL 2 000; 2.NADC-30 like PRRSV; 3.HP-PRRSV; 4.Classical PRRSV; 5～9.被检样品

2.4 PRRSV ORF5氨基酸序列比对分析

通过序列比对分析，可以看到GP5蛋白变异最大的区域位于1-25aa位的信号肽区域和27-30aa诱骗性表位区域，多序列在诱骗表位(27-30aa)存在氨基酸突变，由A29突变为V29。主要中和表位PNE(37-45aa)处也存在氨基酸突变，HP-PRRSV毒株L39全部突变为I39，2018HZAU-FJNP-419等多毒株的PNE处L39全部突变为S39、H38全部突变为Y38(图2)。

表3 2017-2018 PRRSV病料检测结果

图2 PRRSV ORF5基因进化树

图3 PRRSV GP5蛋白质序列分析(0-100)

3 讨论

PRRSV基因组具有高度的变异性，极易获得免疫逃避，给防控该病带来极大困难，监测PRRSV的流行情况和遗传变异，对防控PRRS意义重大。2017年-2018年，共检测了来自中国16省份76个猪场的309份临床病料，结果显示，PRRSV阳性率38.51%，其中HP-PRRSV毒株91份，占总阳性样品数的76.5%；NADC30-like毒株28份，占总阳性样品数的23.5%。说明在中国占主导地位仍然是HP-PRRSV毒株，其次为PRRSV NADC-30样毒株。

我国已使用了7种减毒活疫苗(CH-1a/CH-1R、VR2332/Ingelvac PRRS MLV、R98/r998 MLV、JXA1/JXA1-r、TJ/TJM-F92、HuN4/HuN4-f112、GD/GDr180等)，不仅没有取得很好地防控效果，还加速了PRRSV的变异。PRRSV基因重组不仅发生在疫苗毒株和野生毒株之间，甚至发生在两个疫苗毒株之间[10]。部分毒株GP5的氨基酸与HP-PRRSV代表株JXA1的氨基酸相似性高达96.6%,毒株可重组来增加其多样性。应加强猪群混养前的毒株检测避免PRRSV疫苗株的重组，并谨慎使用MLV疫苗。

由于ORF5 (GP5)高变异性，一直被作为PRRSV遗传变异分析的目标。GP5与免疫保护和免疫逃逸密切相关[11-12],对本研究中测得的53株PRRSVORF5基因推导的GP5氨基酸序列与国内外报道中常用的代表毒株进行序列比对分析，GP5蛋白变异最大的区域为1-25aa的信号肽区域和27-30aa诱骗性表位区域，多序列在诱骗表位(27-30aa)存在氨基酸突变，由A29突变为V29。主要中和表位PNE(37-45aa)处也存在氨基酸突变，HP-PRRSV毒株L39全部突变为I39，2018HZAU-FJNP-419等多毒株的PNE处L39全部突变为S39、H38全部突变为Y38。这些突变可能与疫苗的免疫逃避有关，具体免疫逃避机制有待进一步研究。

HP-PRRSV和NADC-30样毒株是国内PRRS的主要致病毒株，应开展进一步调查，全面了解PRRSV在中国的流行情况。与HP-PRRSV相比，NADC30样PRRSV的ORF5在信号肽、主要线性表位和潜在的n-糖基化位点等重要区域发生了明显的氨基酸置换。应重视改良的活疫苗衍生物，有可能转为毒株，使PRRSV的防控更加复杂。