李 楠，阮婷玉，孙天浩，康立超，彭 健，王 静*，马 勋*

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2.新疆农垦科学院分析测试中心，新疆石河子 832003)

单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)简称单增李斯特菌，是一种重要的食源性胞内病原体，由其引起的疾病能够侵害多种家畜、野生动物和人类，属自然疫源性人兽共患病。17多种禽类(如鸡、火鸡、鸽子和水禽等)对LM敏感[1]，LM感染禽类后通常导致肠、脾、肝、肾、心脏、肺和气囊局部坏死[2]。LM耐受低温环境，常污染冷藏、冷冻食品[3]。评估宿主与LM病原体相互作用的体外和体内模型有很多，包括组织培养、小鼠、豚鼠、秀丽隐杆线虫[4]、果蝇和斑马鱼等。鸡胚已经被用来确定许多不同微生物的感染能力，包括细菌、真菌、寄生虫和病毒[5]。本文以2株冷冻鸡肉中分离的LM为研究对象，以鸡胚作为感染模型，对分离株的毒力及其相关致病因素的差异进行研究，以期为实验易感动物的扩展、食源性LM的致病机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和实验动物 2株冷冻鸡肉来源的LM分离株，编号为LM873和LM925，无害李斯特菌(L.innocua)，均由石河子大学预防兽医学实验室保存；鸡胚由乌苏市鑫湖养鸡农民专业合作社提供。

1.1.2 主要试剂及引物 脑心浸液培养基(BHI)、10 g/L亚碲酸钾溶液，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品；2×PCR Mix，广州东盛生物科技有限公司产品；DNA Marker，北京全式金生物技术有限公司产品；结晶紫，索莱宝生物科技有限公司产品；草酸铵，天津市北联精细化学品开发有限公司产品；NaCl，国药集团化学试剂有限公司产品。引物参考文献[6]设计8对引物(表1)，由北京华大基因公司合成。

1.1.3 主要仪器 细菌振荡培养箱(IS-RDV 1)，苏州捷美电子有限公司产品；普通PCR仪(ArKtiK)，德国Thermo公司产品；台式高速冷冻离心机(LabCYCIeV)，美国Bio-Rad产品；酶标仪(POWER WAVE XS)，美国BIOTEK公司产品；电泳仪(CS-500V)，英国Cleaver公司产品；孵化机，大江电子有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 鸡胚毒力测定 将鸡胚在37.9℃、53%湿度条件下孵育至14日龄，将LM873、LM925和L.innocua摇菌至对数生长期，然后进行菌量测定，将0.1 mL倍比稀释的细菌经绒毛尿囊膜接种鸡胚，对照组注入0.1 mL PBS，每组5枚鸡胚。接种后继续在相同条件下孵育，每天监测胚胎死亡情况至20日龄，用改良寇氏法计算菌的50%致死量(LD50)。计算公式：LD50=log-1[Xm-i(∑P-0.5)]，其中：Xm为接种的最大剂量的对数；P为各组动物的死亡率；∑P为各组动物死亡率总和；i为组间距。

表1 本试验所用PCR引物

1.2.2 鸡胚肝脏指数测定 及时取出死亡鸡胚并剖检，观察其肝脏变化，称重鸡胚与肝脏，计算肝脏指数。对未死亡鸡胚在20日龄时剖检，操作同上。

1.2.3 毒力基因PCR检测 将LM873、LM925和L.innocua摇菌至对数生长期，收集菌液于-20℃保存备用。通过PCR扩增上述8个毒力基因，产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定分离株有无毒力基因。 PCR扩增体系:2×PCR mix 12.5 μL，lmo0833、lmo2672、lmo1188、lmo1134、lmo0834、lmo2470、lmo1116和lmo2821基因的上、下游引物(25 μmol/L)各0.5 μL，菌液2 μL，剩余用超纯水补足25 μL。PCR扩增程序：94℃ 2 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃延伸45 s，共35个循环；72℃ 2 min。

1.2.4 溶血活性测定方法 采集健康绵羊全血，制备成10 mL/L绵羊红细胞悬液。将菌液离心后取上清液，用PBS缓冲液调OD600nm值至相同大小，加入96孔板，加入等体积的10 mL/L绵羊红细胞悬液37℃作用2 h，并以PBS缓冲液作为空白对照，将能产生50%溶血的最高稀释倍数表示为溶血价。

1.2.5 生物被膜形成能力的测定 将3株菌分别培养，每孔加入180 μLBHI和20 μL培养菌液于96孔细胞培养板中，至每孔OD600nm值≈0.4～0.6，8个平行重复，37℃条件下静置培养2、4、6、8、10、12、24、36、48 h，吸去孔中的培养物，PBS洗涤3～5次，采用结晶紫染色法[7]，每孔加100 μL 10 g/L结晶紫染色20 min，弃染液，PBS洗涤3～5次，倒置显微镜下观察不同时期生物被膜的形成状态。每孔加入950 mL/L乙醇脱色30 min，测定OD600nm值。

2 结果

2.1 冷冻鸡肉LM分离株鸡胚毒力测定结果

将不同浓度菌液经绒毛尿囊膜接种于14日龄鸡胚，连续观察和记录至21日龄，发现L.innocua组和PBS对照组对鸡胚无致死性，其他分离株均有致死性，其中接种LM925的鸡胚在16日龄开始死亡，死亡时间集中在16日龄～18日龄，接种LM873的鸡胚在17日龄开始出现死亡情况死亡集中在17日龄～20日龄，2株菌对鸡胚的致死率存在差异，用改良寇氏计算法进行统计发现，LM925的LD50为1.533，LM873的LD50为4.733，相差3.2个数量级(表2)。

2.2 鸡胚肝脏指数

鸡胚解剖称重发现，攻毒鸡胚的肝脏指数高于PBS和L.innocua组，差异显著(P<0.05)，但2个分离株之间以及L.innocua和PBS之间无显著差异(表3)。

2.3 毒力基因检测

3株菌毒力基因检测结果显示，8个毒力基因均不存在于L.innocua中，lmo1116基因只存在于LM925中，除此之外其余7个毒力基因LM873和LM925均含有(图1)。

2.4 分离菌株溶血活性的测定结果

溶血活性结果显示L.innocua不溶血，LM925溶血价为24，LM873溶血价为23(图2)，LM925的溶血能力比LM873高2倍。

表2 LM分离株接种鸡胚半数致死量(LD50)统计结果

表3 鸡胚肝脏指数测定结果

M.DNA标准DL 10 000 ；1.LM873；2.LM925；3.L.innocua；4.空白

2.5 生物被膜形成能力的测定

结晶紫染色法检测LM925、LM873和L.innocua的生物被膜形成能力。结果显示，6 h开始出现疏松的结构；8、10、12、24h时，逐渐形成明显有序的网状结构，36 h生物被膜的结构最明显，且密集程度最高，其中LM925的生物被膜最致密也最完整；48 h时网状结构开始瓦解，LM925还可见到松散的网格，而LM873和L.innocua的生物被膜已经完全消失(图3)。

生物被膜形成不同时间点OD600nm测定结果显示，6、8、10、12、24、36 h时，LM925与LM873相比，生物被膜的形成均差异显著(P<0.05)，且在10、24、36 h时，LM925较LM873的差异极显著(P<0.01)，48 h时，LM925与LM873无显著差异(P>0.05)，而LM873与L.innocua仅在24 h时差异显著(P<0.05)(图4)。

3 讨论

由于LM在肉类食品中污染广泛，危害性大，因此，加强对LM的检测很重要。有研究对LM无毒株和强毒株的比较，筛选得到仅存在于强毒株的lmo0833、lmo0834和lmo1188基因。又通过比较EGD-e和L.innocua的转录调节因子和内化素筛选出lmo1116、lmo2672和lmo1134等转录调节因子基因，lmo2470和lmo2821等内化蛋白[6]。发现这8个毒力基因与L.innocua均无同源序列，小鼠毒力测定和大量细菌菌株PCR检测，结果显示这8个毒力基因可区分有毒和无毒LM分离株。本试验对这8个毒力基因的检测显示，L.innocua中不含8个毒力基因，LM925比LM873多1个lmo1116，而lmo1116是一个转录调节剂，可能调控了其他毒力基因的表达。本试验LM925的溶血活性强于LM873。单增李斯特菌溶血素O(listeriolysin O，LLO)作为LM致病最重要的毒力因子之一[8]，LM能够利用进入宿主细胞细胞质躲避宿主免疫系统的攻击、摄取营养并增殖，这一过程很大程度上依赖LLO[9]，鸡胚模型中LLO在LM导致鸡胚死亡过程中发挥关键性作用[2]。2株冷冻鸡肉LM分离株的毒力差异较大，其中LM925的LD50结果比LM873高3.2个数量级。综合毒力基因和溶血活性结果，确定LM925与LM873为有毒株，虽然LM925生物被膜的形成能力强于LM873，但LM873与L.innocua却无明显差异。结果推测2株冷冻鸡肉分离株毒力差异与溶血素活性和lmo1116基因有关。

图2 LM873、LM925与L.innocua溶血价测定结果

图3 不同时间段生物被膜的观察结果

*P<0.05；**P<0.01图4 LM生物被膜形成能力测定结果

生物被膜是附着于物体表面的微生物群落，能够保护内部细菌免受免疫系统和抗菌药物的作用[10]，生物被膜也易导致食品的持续污染。本试验发现LM925与LM873均具有形成生物被膜的能力，6 h有少量微菌落的形成，8 h开始生物被膜逐渐形成，36 h形成最致密、完整的生物被膜，48 h开始分散。由于生物被膜对消毒剂、低温等不利环境耐受性强，食品源LM一旦生成生物被膜，对食品安全的危害将更大。本试验以鸡胚作为感染模型，发现鸡胚对LM敏感，是LM感染的理想模型，而毒力相关因素分析表明2株菌为强毒株，且LM的毒力主要与溶血素活性和lmo1116相关。冷冻鸡肉LM分离株具有生物被膜形成能力，同时能致鸡胚死亡，提示养禽业与食品业应加大对LM的管控力度。