蔡 爽 郑丽端

(华中科技大学 同济医学院附属协和医院 病理科， 湖北 武汉 430022)

胃癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在全球范围内其发病率高居恶性肿瘤第5位，其死亡率位于所有癌症死亡的第4位[1]。在胃癌的前期研究工作中，我们将目光聚焦于c-MYC这一重要原癌基因。c-MYC是碱性螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链(basic helix-loop-helix-leucine Zipper, bHLH-LZ)转录因子家族成员之一，在多种肿瘤中高表达，参与机体内多种生物过程[2-3]。研究发现c-MYC可参与调控自噬，在骨肉瘤中，MYC通过自噬途径促进骨肉瘤细胞增殖[4-5]。自噬是一种机体内存在的动态过程，可驱动受损或不需要的物质递送至溶酶体中进行降解[6]。此外，自噬通过提供循环营养和能量来促进肿瘤发展[7]。本研究旨在探讨c-MYC对胃癌细胞增殖、侵袭功能的影响及其在自噬中的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

AGS人胃腺癌细胞系来源于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，具有短串联重复序列(short tandem repeat, STR)细胞鉴定报告。

1.1.2 试剂

RPMI-1640完全培养基(美国Thermo公司)；RPMI-1640细胞培养基粉末(美国Gibco公司)；青-链霉素双抗溶液(美国Thermo公司)；胎牛血清FBS(美国 Thermo公司)；PBS缓冲液(谷歌生物科技有限公司)；胰蛋白酶(谷歌生物科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(谷歌生物科技有限公司)；TRIzol RNA分离试剂(美国Thermo公司)；PrimeScript TM RT Master Mix试剂盒(Takara 生物技术有限公司)；2×Taq Master Mix(南京Vazyme生物科技股份有限公司)；PVDF膜(美国Thermo公司)；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术公司)；Neofect细胞转染试剂(零客创智生物科技有限公司)；Matrixgel(美国BD公司)；抗体(武汉ABclonal生物科技有限公司)；DAPI荧光染料(塞维尔生物科技有限公司)。本研究引物均由武汉擎科生物公司合成(表1)。

表1 实时引物名称及序列

1.1.3 质粒

人c-MYC真核表达质粒(Lenti-CV186-c-MYC)、RNA干扰质粒(Lenti-GV298-sh-c-MYC)、过表达质粒空载(Lenti-CON294)、敲低质粒空载(Lenti-GV298-sh-Scb)、LC3-Cherry-EGFP质粒(pmCherry-EGFP-LC3B-h)均购于上海吉凯基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标本的收集

收集武汉协和医院2021年9月～2021年10月收治的8例胃癌患者的胃癌组织及对应癌旁组织标本，所有标本均经本院病理科诊断为胃癌。胃癌组织标本及对应的癌旁组织标本(距肿瘤边缘>5 cm处为准)离体后立即置入液氮中，保存备用。本研究已通过华中科技大学同济医学院伦理审查委员会审核。

1.2.2 细胞培养与转染

人胃腺癌细胞系AGS采用RPMI-1640培养基(含1%青-链霉素溶液，10% FBS)，于37℃恒温、5% CO2的环境下培养。AGS细胞长满至T25培养瓶的80%～90%时，胰蛋白酶消化至细胞成单个圆形，等体积培养基终止消化，并将细胞悬液接种于6孔板中，观察细胞密度达到60%～70%时，可进行转染实验。转染体系配制：2 μg质粒，2 μL Neofect转染试剂，100 μL无血清RPMI-1640培养基，混匀，静置20 min，避免紫外照射。转染前2 h，对细胞进行换液处理，于6孔板中加入转染体系，可将6孔板十字法摇晃混匀。静置培养箱中48 h后，荧光显微镜下观察细胞荧光情况，并开始进行嘌呤霉素筛选，从而获得稳定的c-MYC过表达细胞株及敲低细胞株。后续实验将使用此稳转细胞株。

1.2.3 Western blot

刮取稳转细胞，1 000 rpm×5 min离心收集细胞，弃上清后，向沉淀中加入1∶1体积的蛋白裂解液(RIPA)，冰上静置5 min，超声裂解30 s。BCA法测定蛋白浓度，以每孔30 μg计算上样量。80 V恒压电泳至蛋白Marker分开，上调电压至110 V，继续电泳约1.5 h至可分开目的条带。切取所需目的条带，剪裁大小适宜的PVDF膜，覆盖在胶条上，避免气泡。恒流300 mA湿法转膜1 h；5%浓度的脱脂牛奶室温封闭1 h，减少非特异性条带的干扰；一抗室温摇床孵育4 h，二抗室温孵育1 h，使用UVP凝胶成像仪曝光成像。内参选用β-actin，蛋白分子量大小为43 kDa。

1.2.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

使用TRIzol试剂提取样品总RNA，并立即将其逆转录获得cDNA，qRT-PCR的反应体系按说明书配制，于PCR反应板上样后上机。PCR反应条件：95℃预变性，5 min；95℃变性，10 s；55℃退火，10 s；72℃延伸，根据产物长度调整延伸时间；循环重复扩增35次；内参为β-actin，结果采用2-ΔΔCt法分析。

1.2.5 MTT检测

将状态良好的AGS稳筛细胞以2×103个/孔的密度接种于96孔板，每个分组设置3个复孔。在对应的时间点更换细胞培养基(24 h、48 h、72 h以及96 h)，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培养箱中孵育4 h。终止培养，小心吸去孔中培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，震荡10 min，操作注意避光。立刻使用酶联免疫检测仪测量490 nm波长处各孔的吸光度，计算每组吸光度平均值。

1.2.6 软琼脂克隆形成实验(Soft Agar Assay)

2×RPMI-1640(2%抗生素，无血清)和低溶点琼脂糖(1.2%)等体积混匀，6孔板的每个孔中加入3 mL，室温静置凝固形成下层胶。2×RPMI-1640培养基(2%抗生素，20%胎牛血清)和低溶点琼脂糖(0.5%)等体积混匀，冷却至35℃左右，加入200 μL细胞悬液(含细胞约2×103个)，上下颠倒混匀，每组各取3 mL加入成型的下层胶之上。于培养箱中培养4周，显微镜下观察细胞克隆状态，MTT溶液染色，并对克隆形成计数。

1.2.7 基质胶侵袭实验(Transwell)

24孔板每孔加入500 μL RPMI-1640培养基(含1%青-链霉素溶液，10%胎牛血清)，50 μL基质胶包被Transwell小室，并将其放入含培养基的孔中。将200 μL无血清培养基重悬的细胞悬液(含细胞约5×103个)加入小室内，静置培养48 h。弃培养基，甲醇固定15 min，结晶紫染色2 h。棉签擦去上室细胞后，倒置显微镜下拍照计数。每个小室在相同放大倍数下，拍取9个视野，并对每个视野下的细胞进行计数，取平均值。

1.2.8 自噬流检测

取对数生长期的稳转细胞，以适宜密度接种于24孔板(5×103个/孔)。LC3-Cherry-EGFP质粒转染48 h后，弃培养基，用甲醇固定细胞。用2 μg/mL DAPI染剂每孔200 μL进行细胞核染色，染色时间为15 min。弃染剂后，防荧光淬灭封片剂封片，于激光共聚焦显微镜下观察样品。自噬流的量与自噬情况成正比。

1.2.9 公用数据库分析

本研究使用了Kaplan-Meier Plot、BioGRID、Harmonizome等数据库进行生物信息学分析。其中通过BioGRID数据库，我们得到自噬相关基因492个；使用Harmonizome数据库找到c-MYC下游靶基因共1 102个；通过Kaplan-Meier Plot数据库对ATG7进行胃癌病例的生存分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0进行数据分析。计量资料均以均值±标准差表示，组间差异使用t检验分析。皮尔逊相关系数测定法分析两个基因之间的表达相关性。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 c-MYC在胃癌组织中高表达

对收集的胃癌组织和癌旁组织分别进行了qRT-PCR和Western blot检测，结果显示，相比于对应的癌旁组织，胃癌组织中c-MYC的表达明显升高(见图1A～1B)。

2.2 c-MYC促进AGS胃癌细胞的增殖和侵袭

采用空载质粒(Mock)和c-MYC过量表达质粒(c-MYC)转染胃癌AGS细胞，并嘌呤霉素筛选，获得了c-MYC过表达的稳定细胞株。通过qRT-PCR和Western blot检测发现，c-MYC表达上调(图2A、2B)。MTT和软琼脂克隆形成实验发现，相比于对照组，过表达c-MYC能明显促进胃癌AGS细胞的增殖(图2C、2D)。基质胶侵袭实验发现，相比于对照组，过表达c-MYC能明显促进胃癌AGS细胞的侵袭(图2E)。

2.3 下调c-MYC抑制AGS胃癌细胞的增殖和侵袭

用空载质粒(sh-Scb)和c-MYC敲低的质粒(sh-c-MYC#1、sh-c-MYC#2)转染胃癌AGS细胞，并用嘌呤霉素筛选，获得了c-MYC敲低的稳定细胞株。通过qRT-PCR和Western blot检测发现，相比于sh-Scb组，sh-c-MYC#1和sh-c-MYC#2组中c-MYC表达明显降低(见图3A、3B)。MTT和软琼脂克隆形成实验发现，相比于对照组，下调c-MYC能明显抑制胃癌细胞AGS的增殖(图3C、3D)。基质胶侵袭实验发现，相比于对照组，下调c-MYC能明显抑制胃癌细胞AGS的侵袭(图3E)。上述结果提示，c-MYC可能是胃癌发生发展中重要的促癌分子。

注：qRT-PCR(A)和Western blot(B)检测胃癌组织及其对应的癌旁组织(距肿瘤边缘>5 cm处为准)中c-MYC的表达水平。均以β-actin为内参；1～8分别代表标本1～8号组织；两组相比较，*P<0.001图1 qRT-PCR和Western blot检测胃癌及癌旁组织中c-MYC的表达水平

注：qRT-PCR(A)和Western blot(B)分别在转录和翻译水平检测c-MYC在AGS胃癌细胞中的过表达效率，以β-actin为内参；MTT检测c-MYC对AGS胃癌细胞增殖的影响(C)；软琼脂克隆形成实验检测c-MYC对AGS胃癌细胞克隆形成能力的影响(D)；基质胶侵袭实验检测c-MYC对AGS胃癌细胞侵袭能力的影响(E)。两组间比较，*P<0.001图2 过表达c-MYC对胃癌AGS细胞生物学功能的影响

注：qRT-PCR(A)和Western blot(B)分别在转录和翻译水平检测c-MYC在AGS胃癌细胞中的表达，以β-actin为内参；MTT检测c-MYC对AGS胃癌细胞增殖的影响(C)；软琼脂克隆形成实验检测c-MYC对AGS胃癌细胞克隆形成能力的影响(D)；基质胶侵袭实验检测c-MYC对AGS胃癌细胞侵袭能力的影响(E)。两组间比较，*P<0.001图3 下调c-MYC对胃癌AGS细胞生物学功能的影响

2.4 c-MYC调控自噬相关基因ATG7

c-MYC是研究较多的转录因子，能够与多种蛋白相互作用，调节基因的转录[8]。我们通过BioGRID和Harmonizome数据库[9]发现，c-MYC调控靶基因自噬相关蛋白7(autophagy related 7, ATG7)(图4A)。通过KM曲线生存分析发现，高水平ATG7的死亡风险高于低水平ATG7(P<0.001)(图4B)。在稳转细胞中，通过qRT-PCR和Western blot分别检测了ATG7在转录水平和翻译水平的情况。与对照组相比，过表达c-MYC时，ATG7的水平明显升高；反之，敲低c-MYC时，ATG7的水平明显下降(见图4C、4D)。由于ATG7与自噬联系紧密，所以对稳转细胞进行了自噬流的检测，结果如图4E所示，与对照组相比，过表达c-MYC组中自噬流明显增加，而在敲低c-MYC时，自噬流明显降低。上述实验结果表明，c-MYC通过上调ATG7的表达从而促进自噬。

3 讨论

胃癌早期无明显症状，一经发现，多为中晚期[10]。研究发现，目前接受手术治疗的Ⅲ期胃癌患者的5年生存率为18%～50%[11]。这一数据表明现阶段需要更有效的分子治疗策略，来提高中晚期患者的5年生存率。

c-MYC是bHLH-LZ转录因子家族的成员，可调节细胞生长、分化、代谢和死亡，并且在多种肿瘤中高表达[2,12-13]。c-MYC可通过改变选定MYC抑制基因(MYC-repressed genes，MRG)转录物中的m6A修饰来抑制基因表达，从而促进癌症发展。研究发现c-MYC与CD44、CD24、乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)等乳腺癌干细胞标志物呈正相关，其可作为乳腺癌诊断和预后的预测指标。在胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine tumor, pNET)中，c-MYC通过直接结合到血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGFC)启动子的E-box区域来上调VEGFC表达和pNET细胞的分泌[14-16]。此外，c-MYC还是一个重要转录因子，能够与多种蛋白相互作用，调节基因的转录[8]。

通过数据库分析，我们发现了c-MYC的靶基因，自噬相关蛋白ATG7。ATG7是核心ATG蛋白，它通过脂化ATG8来驱动经典自噬降解[17]。研究发现ATG7拥有E1样酶活性，在自噬过程中能够驱动磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)与LC3-I结合，产生LC3-II，促进自噬过程[18]。ATG7还可调节P53活性，影响细胞周期进程和细胞凋亡[19]。c-MYC参与自噬过程早有大量报道。组蛋白赖氨酸甲基转移酶G9a通过直接和转录激活c-MYC来调节胶质母细胞瘤细胞增殖和自噬；MYC通过自噬途径促进骨肉瘤细胞增殖；在非小细胞腺癌中，c-MYC/miR-150/EPG5介导的自噬功能障碍有助于肿瘤的发展[5,20-21]。但在胃癌中，c-MYC与自噬相关蛋白ATG7的关系尚未有明确阐述。

注：将自噬相关基因与c-MYC靶基因进行overlap分析(A)，分析得到在胃癌中生存有意义的靶基因ATG7(B)；qRT-PCR(C)和Western blot(D)分别检测过表达c-MYC和c-MYC敲低的AGS细胞系中ATG7表达水平，以β-actin为内参；分别在过表达c-MYC和c-MYC敲低的AGS细胞系中转染LC3-EGFP-Cherry质粒，共聚焦检测自噬流的变化情况(E)；Scale bar值为10 μm。两组间比较，*P<0.001图4 胃癌细胞AGS中c-MYC对靶基因ATG7的调控作用

本研究通过体外实验，发现过表达c-MYC能促进胃癌细胞的增殖和侵袭。我们在胃癌临床标本上也进行了验证，结果表明相较于癌旁组织，胃癌组织中c-MYC表达明显增加。通过数据库分析，我们发现ATG7是c-MYC所调控的靶基因，并且我们对这一结论进行了验证，发现c-MYC正向调控ATG7的表达。ATG7与自噬关系密切，在自噬流检测中可以发现过表达c-MYC会促进自噬，而敲低c-MYC则会抑制自噬。由此，我们认为c-MYC通过正向调控ATG7来影响自噬，进而调节胃癌的发生和发展。