孔繁皓，张鸿洋，张蔚，赵一诺，丁晓慧，杨智航，苏秋香，解辉*

（1.沈阳医学院基础医学院2018级临床医学专业14班，辽宁 沈阳 110034；2.2019级临床医学专业5班；3.组织胚胎学教研室；4.生理学教研室；5.形态学中心）

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI） 是指由各种外伤导致脑组织严重损害的一类疾病，具有高发生率、高致残率等特点［1］。研究发现人脑外伤后血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的完整性遭到破坏［2］，它不再是血管内皮和大脑之间完美的保护屏障，其功能障碍导致液体、蛋白质和免疫细胞的渗出，从而形成血管源性脑水肿，继发一系列的神经损伤，甚至留下严重的神经功能障碍［3］。因此改善BBB 的完整性对于改善TBI 的预后至关重要。研究表明紧密连接是维持体内BBB 完整性的重要结构和功能基础，并且在调节细胞旁通透性方面起重要作用。目前，ZO-1、Occludin 和Claudin-5 是研究紧密连接的标志蛋白，他们的变化直接影响紧密连接的状态，进而影响BBB 的细胞旁通透性。瞬时性受体电位通道香草酸受体4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）是位于细胞膜上的一类重要阳离子通道家族成员之一，其在不同大小的动脉毛细血管内皮细胞均有表达，TRPV4 激活可引起Ca2+内流和NO 的释放，最终使细胞骨架重塑［4］。研究已经证明细胞内Ca2+浓度的增加以及NO表达水平的增高均是BBB开放的重要因素［5-6］。我们推测TBI 后BBB 完整性的破坏可能与脑微血管内皮上TRPV4 通道的异常激活相关，其作用机制可能通过紧密连接开放的细胞旁途径实现。本文拟建立大鼠TBI 动物模型，探讨TRPV4 通道抑制剂对TBI后BBB完整性破坏的作用和可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性SD 大鼠66 只，体重250～300 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，饲养于沈阳医学院实验动物研究中心，实验动物许可证号：SCXK（辽）2020-0001。动物房12 h/12 h 昼夜交替，动物自由饮水、进食，23～25 ℃，适应性喂养1 周后进入实验。术前所有动物禁食12 h，但自由饮水。本研究遵循单位和国家有关实验动物管理和使用的规定。

1.2 材料 TRPV4 通道抑制剂HC067047（美国MedChemExpress 公司）、Claudin-5 和Occludin 抗体（美国Santa Cruz 公司），伊文思蓝（美国Sigma 公司），Western blot 试剂盒（博士德生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠TBI模型制备 参照Feeney等［7］自由落体致伤法制作大鼠大脑顶叶局灶皮质挫裂伤模型。10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，并固定于脑立体定位仪上。剪开颅顶部皮肤，确定前囟点。以前囟后1.5 mm、右2.5 mm处为中心，钻一直径5 mm骨窗，暴露硬脑膜。将撞击头移至硬脑膜上方，导管最下端平面与撞击头上的环形标记齐平，用20 g打击锤于20 cm处沿外周导管坠落致大鼠右侧大脑顶叶挫裂伤。打击后用骨蜡封闭骨窗，缝合头部皮肤。动物模型制备后，根据神经功能缺损评分（mNSS）判断，筛选模型成功动物进行后续实验。

1.3.2 给药方法和实验分组 为了明确TBI 后BBB通透性的变化，SD大鼠按时间点随机分为假手术组（Sham）组和TBI 3 h 组、1 d 组、3 d 组、7 d组。Sham组仅去除骨瓣，不致脑损伤。在确定BBB通透性峰值时间点之后，选取3 d作为代表性时间点组， 并给予TRPV4 通道抑制剂HC067047，之后的实验随机分为：Sham 组，TBI 3 d 组、TBI 3 d+HC067047 组。HC067047 于TBI 后立即给药，之后每8 h 给药一次，直至实验结束，每组6只大鼠。

1.3.3 BBB 通透性的测定 大鼠BBB 的通透性采用伊文思蓝的渗出量定量评估。用生理盐水配制2%伊文思蓝（2 mg/kg）。麻醉大鼠后，在每个时间点的前2 h，由大鼠股静脉给予2%伊文思蓝溶液作用2 h，之后暴露大鼠胸腔经左心室灌注肝素化生理盐水，直至右心耳处流出无色液体为止。大鼠断头后沿矢状缝分离两侧大脑半球并称重，再放入甲酰胺（1 ml/100mg）中60 ℃孵育24 h。在分光光度计上测定620 nm 处的吸光度值，计算伊文思蓝含量。

1.3.4 干湿重法检测脑组织含水量 各组大鼠经过处理后，断头取脑，去除脑干，称湿重；106 ℃烘干至恒重，得干重，计算脑组织含水量。

1.3.5 Western bolt 法检测大鼠脑损伤组织中Occludin和Caudin-5蛋白的表达 各组大鼠经过处理后，断头取脑，提取脑损伤组织，分离血管段，将血管段成分匀浆离心、测定蛋白浓度；蛋白分离采用12%SDS-PAGE电泳，然后转印到硝酸纤维素膜上，分别孵育一抗Occludin 和Caudin-5（1∶500）4 ℃过夜；再孵育相对应二抗室温作用2 h；以β-actin 作为内对照，经增强化学发光法发光，采用Chemi Imager 5500V 2.03 软件扫描胶片，Fluor Chem 2.0 图像分析仪对条带积分光密度进行定量分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，组间两两比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HC067047 对大鼠TBI 后BBB 通透性的影响 大鼠发生TBI 后，BBB 通透性明显增加，于3 d 达峰值，之后逐渐降低，7 d 基本恢复到正常水平；应用TRPV4 通道抑制剂HC067047 后，TBI 3 h组、TBI 1 d组和TBI 3 d组的BBB通透性较同时间点的TBI组明显降低，见图1。

图1 TRPV4抑制剂HC067047对TBI后BBB通透性变化的影响

2.2 HC067047 对大鼠TBI 后脑组织含水量的影响 TBI 3 d 组大鼠脑组织含水量较Sham 组明显增加，然而TBI 3 d+HC067047 组的脑组织含水量明显减少，见图2。

图2 TRPV4抑制剂HC067047对TBI后脑组织含水量变化的影响

2.3 HC067047 对大鼠TBI 后脑损伤区域微血管上紧密连接蛋白Occludin 和Caudin-5 表达的影响 TBI 3 d组大鼠脑损伤区域微血管上紧密连接蛋白Occludin 和Caudin-5 的表达较Sham 组均明显减少，然而TBI 3 d+HC067047 组的紧密连接蛋白Occludin 和Caudin-5 的表达均有所恢复，见图3。

图3 TRPV4抑制剂HC067047对TBI诱导的BBB破坏Claudin-5和Occludin蛋白表达的影响

3 讨论

在本研究中，伊文思蓝渗透评估结果表明大鼠发生TBI后，BBB通透性明显增加，于3 d达峰值，7 d 基本恢复到正常水平；TBI 后立即给予TRPV4 通道抑制剂HC067047，各时间点BBB 通透性的增加受到明显的抑制；同时应用干湿重法检测脑组织含水量，发生TBI后3 d的大鼠脑组织含水量较对照组明显增多，应用HC067047 后，TBI 3 d+HC067047 组大鼠脑组织含水量较TBI 3 d组明显减少；进一步应用Western bolt 法检测大鼠脑损伤组织微血管中紧密连接蛋白Occludin和Caudin-5的表达，发生TBI后3 d的大鼠脑损伤区域紧密连接蛋白Occludin 和Caudin-5 的表达较对照组明显减少，应用HC067047 后，TBI 3 d+HC067047组大鼠紧密连接蛋白Occludin和Caudin-5的表达较TBI 3 d 组明显增多。上述结果提示，TBI 发生后BBB 完整性受到损坏，其通透性明显增加，并且诱发了脑水肿，抑制TRPV4 功能对TBI 后BBB 破坏具有保护作用；TBI 后BBB 完 整性的破坏可能是通过下调紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5 的表达水平，开放紧密连接实现；抑制TRPV4 功能可能通过部分抑制紧密连接蛋白Occludin和Claudin-5的表达减少，进而实现对TBI后BBB破坏的保护作用。

目前，关于TRPV4 通道介导的TBI 后BBB 开放相关信号通路并不清楚。Liao 等［8］的研究表明TRPV4 通过Ca2+/PKC-δ 信号途径促进声波介导的BBB 开放。TRPV4 通道异常激活，引起Ca2+内流，使细胞骨架重塑［4］。钙介导的信号途径，如PKC 途径，能够调节上皮细胞间紧密连接的完整性［9-12］。紧密连接蛋白介导的细胞旁途径在调节BBB通透性方面起重要作用，我们推测Ca2+/PKC-δ信号途径可能在TRPV4 通道介导的大鼠TBI 后BBB 破坏中发挥重要作用，需要进一步的实验证实。

综上所述，抑制TRPV4 通道激活可以减少TBI 后BBB 破坏程度，其机制可能是通过调节紧密连接蛋白Occludin 和Caudin-5 的表达实现，这可能是TRPV4通道抑制剂减轻TBI后BBB破坏作用的机制之一。