胡懿心，王彩霞，刁为英

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

胃癌(Gastric cancer，GC)是常见的恶性肿瘤之一，其发生发展过程中多种基因和蛋白表达失常，侵袭转移能力强，预后差。当前的胃癌标志物，如：血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA199)在胃癌的诊断和预后方面敏感性和特异性都相对较低[1]。因此，找寻新的、敏感的、特异的生物学标志物是非常有必要的。本文采用免疫组织化学染色(PV6000vision)法检测INHBA和Flot2在胃癌组织中的表达、与临床病理特征的关系，并分析二者在胃癌组织中的相关性，通过探讨INHBA和Flot2的表达变化来提升胃癌的诊疗水平。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用单纯随机抽样的方法在黑龙江省佳木斯大学附属第一医院2018-01～2021-01手术切除的胃癌标本中抽取60例，经我院资深病理医生证实为GC患者，且均为初次手术，术前未行放化疗。收集他们的胃癌组织及距癌组织2～5cm处正常胃组织的石蜡标本、相关临床病理特征资料。其中男32例，女28例；年龄<55岁者19例；肿瘤直径<5cm者20例。肿瘤病理分级根据WHO标准，高+中分化27例，低分化33例；根据2017年美国癌症联合会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)第8版标准对GC进行浸润深度及TNM分期，其中T1+T2为16例，T3+T4为44例；I～II期为26例，III～IV为34例。此外，有脉管侵犯者26例；有神经侵犯者36例；有淋巴结转移者35例。

1.2 免疫组化方法

用10%中性缓冲福尔马林(或 4% 缓冲多聚甲醛)进行标本的固定，将组织脱水包埋，采用免疫组化 PV6000vision法，分别对胃癌和癌旁组织进行INHBA、Flot2 抗原抗体染色。按 1： 100 稀释一抗 INHBA(兔抗人多克隆抗体)，按1:300稀释一抗Flot2(兔抗人多克隆抗体)，均购自Proteintech公司。免疫组化 PV6000Vision 试剂盒(兔)、DAB 染色试剂盒和 EDTA 抗原修复液( pH8.0，pH9.0) 均购自北京中杉金桥。阳性对照INHBA参考人胎儿前列腺组织，Flot2参考人肺癌组织，用PBS代替一抗作为阴性对照，其它具体操作参考说明书。

1.3 判定标准

每张切片观察5个(40×10) 有代表性视野，视野以染色强度和阳性细胞数所占百分比分别计分。其中无染色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别计为 0、1、2、3分；细胞阳性百分比，无阳性细胞为0分； ≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%计为 1、2、3、4分。两项分数相乘， <8分低表达，≥8 分为高表达[2]。所有切片染色结果判定由两名资深病理医生通过双盲法单独进行评定，最后统一评分。

1.4 统计学方法

采用 SPSS20.0 进行数据统计分析，计数资料以n(%)表示,χ2检验，采用spearman等级相关检验分析INHBA与Flot2的相关性，P<0.05差异有统计学意义。

1.5 GEPIA数据库差异表达分析与生存分析

本研究中利用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析了INHBA与Flot2在胃癌及正常胃黏膜样本中的表达差异及二者高表达时对患者总体生存期(Overall Survival，OS)的影响。

2 结果

2.1 INHBA 和 Flot2 在胃癌组织中的表达

INHBA和Flot2在胃癌细胞中有阳性表达，呈棕黄色或棕褐色颗粒状。INHBA定位于细胞浆，Flot2定位于细胞浆和细胞膜。INHBA在GC中高表达率73.33%(44/60)显著高于癌旁正常胃组织8.33%(5/60)，差异有统计学意义(χ2=52.463，P<0.05)，见表1，图1；Flot2在GC中高表达率75.00%(45/60)显著高于癌旁正常胃组织10.00%(6/60)，差异有统计学意义(χ2=51.867，P<0.05)，见表1，图2。

表1 胃癌和癌旁正常胃黏膜组织中INHBA、Flot2的表达

图1 A:INHBA在胃癌组织中阳性表达(×200)； B:INHBA在癌旁正常胃组织中阴性表达(×200)

图2 A:Flot2在胃癌组织中阳性表达(×200)； B:Flot2在癌旁正常胃组织中阴性表达(×200)

2.2 INHBA、Flot2表达与GC临床病理学参数的关系

按照胃癌患者的年龄、性别、肿瘤直径、分化程度、脉管侵犯、神经侵犯、浸润深度、淋巴结转移以及TNM分期分为9组。分别比较、分析不同组别INHBA和Flot2表达水平的差异，结果表明INHBA 的高表达与GC患者的肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有显著相关性(P<0.05)，与年龄、性别、脉管侵犯、神经侵犯无显著相关性；Flot2的高表达与GC患者的肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有显著相关性(P<0.05)，与年龄、性别、肿瘤直径、脉管侵犯、神经侵犯均无显著相关性,见表2。

表2 INHBA、Flot2的表达与60例胃癌临床病理参数的关系

2.3 INHBA 与 Flot2 在胃癌中表达的相关性

有 38 例病例中INHBA和Flot2在肿瘤中表达同为阳性，同为阴性的有9例。应用spearman相关性检验分析发现GC组织中INHBA与Flot2的表达具有显著相关性(r=0.435，P=0.001),见表3。

表3 INHBA与Flot2的表达在GC中的相关性

2.4 GEPIA数据库中胃癌中INHBA、Flot2的表达差异

虽然两种mRNA在胃癌组织中的表达量均高于正常胃黏膜组织，但Flot2的差异表达分析并无统计学意义(P>0.05)。进一步的OS分析中，二者高表达组患者生存情况均差于低表达组，但Flot2的OS分析同样较欠统计学意义(P=0.11)。见图3。

图3 A:胃癌和正常胃黏膜组织中INHBA的表达差异(红色代表胃癌组织，黑色代表正常组织)；B:胃癌和正常胃黏膜组织中Flot2的表达差异(红色代表胃癌组织，黑色代表正常组织)；C:INHBA总体生存期分析；D:Flot2总体生存期分析。

3 讨论

抑制素βA(INHBA)基因定位于7p14.1[3]，作为转化生长因子β(TGF-β)超家族的成员之一 ，它参与生殖细胞的发育和成熟、红细胞分化、下丘脑及垂体激素分泌、性腺激素和胰岛素的分泌、神经细胞存活、胚胎轴向发育或骨生长等过程[4]。有研究人员指出INHBA表达增加与肿瘤直径和肿瘤浸润深度有关，INHBA表达较高的患者无瘤生存率较短[5]。同时，近年来的多项研究表明，INHBA以高表达参与多种癌症的细胞增殖，如食管鳞状细胞癌、肺腺癌、卵巢癌和鼻咽癌等。

本组实验通过观察INHBA在胃癌组织及癌旁正常胃黏膜中的表达差异，发现有 73.33%(44/60)的胃癌组织高表达INHBA，癌旁正常胃黏膜组织中的高表达率仅有 8.33%(5/60)，这两者差异有显著性，与GEPIA数据库分析结论一致。实验数据显示，INHBA高表达的GC患者肿瘤直径更大、分化程度更低、浸润更深、TNM分期更高，有淋巴结转移组中的表达高于无淋巴结转移组以上五个临床病理参数的数据的差异均具有显著性(P<0.05)，与年龄、性别、脉管侵犯、神经侵犯无显著相关性。提示INHBA可能与癌细胞的增殖以及侵袭、迁移密切相关，参与胃癌的进一步恶化，这与GEPIA数据库生存分析显示INHBA高表达患者生存期较短一致。目前关于INHBA的表达与肿瘤临床病理特征的关系的研究较少，Chen等[5]的研究认为在胃癌组织中，INHBA的表达上调，INHBA与癌症直径和肿瘤浸润深度显著相关，并且INHBA表达较高的患者也具有较短的无病生存期；INHBA过表达可以预测第二和第三阶段胃癌的预后。此研究结果与本组实验结果有相似之处。

脂筏是存在于生物膜上的微结构域，其特征蛋白Flot2(脂筏结构蛋白2)，亦称为Reggie-1，大小为48KDa，为一个完整的膜蛋白，且高度保守。在一些乳腺癌细胞系及肿瘤样本中，可有Flot2基因编码的Flot2蛋白的高表达[6]。Flot2在肾癌组织中为高表达，其与肾癌的肿瘤分期、组织学分级、淋巴结转移以及远处转移相关[7]。除此之外，Flot2在鼻咽癌、胃癌、恶性黑色素瘤等肿瘤中均存在异常表达，体内外实验表明肿瘤的进展与其密切相关，这使其可能成为判断肿瘤侵袭及预后的指标[8]。

本组实验通过观察Flot2在胃癌组织及癌旁正常胃黏膜中的表达差异，发现有 75.00%(45/60)的胃癌组织高表达Flot2，癌旁正常胃黏膜组织中的高表达率仅有 10.00%(6/60)，两者的差异有显著性。本组对Flot2的表达与肿瘤临床病理特征的关系研究的实验数据显示，Flot2高表达的GC 患者分化程度更低、浸润更深、TNM 分期更高，有淋巴结转移组中的表达高于无淋巴结转移组，以上四组差异均具有显著性(P<0.05)，与年龄、性别、肿瘤直径、脉管侵犯、神经侵犯均无显著相关性，提示Flot2可能参与胃癌的进一步恶化。Cao等[9]的研究表明，在胃癌患者癌组织和癌旁组织中，Flot2基因在癌组织中的阳性表达率更高，采用si-RNA干扰Flot2的表达后，胃癌细胞的增殖、迁移及转移能力都显著下降，与本组实验结论一致。

在GEPIA数据库中，Flot2在胃癌中的表达量高于正常胃黏膜组织，Flot2高表达组患者生存情况差于低表达组，与实验结果保持了一致，这说明Flot2可能参与了胃癌的发生、发展。但是Flot2的差异表达分析及OS分析较欠统计学意义，与本组实验得到的具有显著性差异的结果有所偏差，这种情况可能与两种分析方式所纳入样本的人种及生存地的不同、样本所处的癌症的不同阶段以及样本量的不足有关。

在肿瘤进展过程中，上皮细胞从其微环境接收的转化生长因子-β (TGF-β)信号可以诱导上皮间质转化(EMT)[10]。EMT被认为是胃癌侵袭转移的关键步骤之一，其发生与多种信号通路有关，其中TGF-β信号通路被认为是EMT的最重要通路之一。有研究表明上调的Flot2在TGF-β介导的上皮间质转化(EMT)相关的胃癌侵袭中起到了关键作用[8]，而INHBA是TGF-β超家族的一员。对INHBA与Flot2是否在同一条通路上调节肿瘤的发生发展及两者在胃癌中的表达是否具有相关性的研究甚少。本组实验结果显示，胃癌中INHBA与Flot2的表达具有一致性及正相关性，提示INHBA和Flot2在胃癌中作用的发挥可能具有协同性。但本研究仅在蛋白水平对两个因子进行了研究，且实验样本例数相对较少、人种单一，其更微观的作用机制并不清楚，所以两者是否真的在同一条通路上协同调节胃癌的发展还需要进一步去扩大样本量、进行细胞和分子水平的实验来进行探索及验证。

总之，本研究显示胃癌中INHBA、Flot2过表达，二者的表达具有正相关性，且它们的高表达预示着淋巴结转移及更高的TNM分期，说明INHBA、Flot2的高表达提示肿瘤有较强的侵袭和迁移能力。深入研究INHBA、Flot2两种蛋白具有重要意义，它们可能成为胃癌未来潜在的新治疗靶点。