杨艳华，张自雄

大肠癌是消化道常见的恶性肿瘤，其发病率及致死率较高，位于肿瘤疾病中的第4～5位[1-2]。随着物质生活水平的提升，人们生活环境、生活节奏及饮食习惯的改变，大肠癌的发病人数每年呈上升趋势[3]。尽管医疗水平不断提高，可应用放、化疗及免疫法等手段进行干预，但是大肠癌5年的生存率仍然较低[4]。对大肠癌发生机制进行深入探讨，对于大肠癌的早期治疗具有重大作用。寻找一种有效的大肠癌治疗药物是目前研究的热点。铁死亡是一种铁离子依赖的过氧化反应引起的细胞死亡模式，和凋亡、坏死及自噬等细胞死亡模式相比，在细胞形态学、生物学及遗传学等方面有较大区别[5]。早期报道[5-6]显示，铁死亡是因为胱氨酸-谷氨酸反向转运体亚基xCT蛋白表达降低时，胱氨酸的摄取减少，导致谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)表达下降，进而引发细胞内活性氧(ROS)过度堆积导致的细胞死亡，这一生物学过程需要铁离子的参与。研究[7]发现，铁死亡与肿瘤发生发展的病理过程相关。

白藜芦醇是多酚类化合物。主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质是肿瘤的化学预防剂，也是降低血小板聚集、预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂[8-9]；王晓燕等[10]发现白藜芦醇能通过下调人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子活性来抑制大肠癌细胞的增殖。然而，白藜芦醇是否能诱导大肠癌细胞铁死亡，尚未见报道。本研究以大肠癌SW480细胞株为体外研究对象，观察白藜芦醇通过抑制xCT、GPX4表达，诱导ROS过度堆积促使大肠癌细胞的铁死亡。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 大肠癌细胞株SW480购自中科院上海细胞库；白藜芦醇(美国Sigma公司)；DMEM培养基(Thermo公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；CCK-8试剂盒(上海纪宁公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海谷歌生物有限公司)；ROS 检测试剂盒均购自碧云天生物技术研究所；xCT、GPX4、二价金属离子转运体1(DMT1)及β-actin抗体购自英国Abcam公司。单人超净工作台(北京六一仪器厂)；BC-J80S型CO2细胞培养箱(北京六一仪器厂)；Victor3 1420 Multilable Counter酶标仪(美国BD，FACS AriaⅢ)；HD-3000型凝胶成像仪(上海上天精密仪器有限公司)；Millipore流式细胞仪(北京维欣仪奥科技发展有限公司)。

1.2 细胞培养 SW480细胞培养于10%胎牛血清的DMEM培养基中，条件为37 ℃、5%CO2、饱和湿度环境，等细胞贴壁生长后，进行常规培养并传代。每2 d换液1次，每天监测细胞形态变化。

1.3 白藜芦醇对SW480细胞增殖的影响 取对数期SW480细胞消化、重悬、调整细胞密度后接种于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜。然后加入不同浓度(0、10、20、40、80、160 μmol/L)白藜芦醇处理细胞24、48、72 h后，除去旧培养液，每孔加入10 μL CCK8溶液，每组设置6个复孔，再置于培养箱中孵育2 h后，置于酶标仪中测定450 nm处的吸光度(OD)值。细胞抑制率(%)=[(1-实验组OD值)/对照组OD值]×100%。

1.4 白藜芦醇对SW480细胞中xCT、GPX4、DMT1表达的影响 取对数期SW480细胞消化、重悬、调整细胞密度后接种于6孔板，置于37 ℃恒温、5%CO2培养箱中培养过夜。然后加入不同浓度(0、20、40、80 μmol/L)白藜芦醇处理细胞48 h后，收集各组SW480细胞，冰上充分裂解30 min，在4 ℃、12 000 r/min低温离心机中离心15 min，然后吸取上清测蛋白浓度。细胞匀浆采用10%SDS-PAGE电泳4 h(电压45 V)，随后转膜，5%脱脂牛奶封闭1 h。把条带对应放入xCT、GPX4、DMT1及β-actin抗体溶液中(稀释比1∶1 000)，4 ℃反应过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，然后室温条件下孵育二抗1 h。TBST洗膜3次，每次10 min，ECL显色后，成像系统进行曝光显影，Image J软件分析蛋白灰度值。

1.5 白藜芦醇对SW480细胞中ROS积累的影响 取对数期SW480细胞消化、重悬、调整细胞密度后接种于6 cm培养皿中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜。然后加入不同浓度(0、20、40、80 μmol/L)白藜芦醇处理细胞48 h后，除去培养液，加入1 mL终浓度为10 μmol/L的2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针工作液，置于37 ℃培养箱中孵育20 min。采用无血清细胞培养液洗涤3遍，采用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，上流式细胞仪检测细胞中荧光强度(激发波长为488 nm，发射波长为525 nm)。

1.6 统计学方法 采用t检验、q检验和方差分析。

2 结果

2.1 白藜芦醇对SW480细胞增殖抑制率的影响 10 μmol/L白藜芦醇对SW480细胞增殖就表现出抑制作用，随着药物浓度的增高，细胞增殖抑制率数值也随之升高。同时，同一浓度白藜芦醇作用不同时间SW480细胞后，随着作用时间的延长，细胞增殖受到抑制的效果更为明显(P<0.01)(见表1)。

表1 各组间SW480细胞增殖抑制率的比较(n=5)

2.2 白藜芦醇对SW480细胞中GPX4和xCT蛋白表达的影响 20、40、80 μmol/L白藜芦醇作用SW480细胞48 h后，细胞中GPX4 和xCT 蛋白表达相对于对照组细胞明显降低(P<0.01)。低、中、高剂量白藜芦醇组间细胞中GPX4 和xCT 蛋白表达也有明显差异(P<0.01)，表现出浓度依赖性(见图1、表2)。

表2 各组间xCT、GPX4蛋白表达的比较(n=5)

2.3 白藜芦醇对SW480细胞中ROS累积、DMT1蛋白表达的影响 结果表明,不同剂量白藜芦醇(20、40、80 μmol/L)干预细胞48 h后，与对照组相比，药物组SW480细胞中产生了大量ROS(P<0.01)，DMT1蛋白表达相对于对照组细胞明显升高(P<0.01)；低、中、高剂量白藜芦醇组间细胞中ROS积累量及DMT1蛋白表达差异有统计学意义(P<0.01)，表现出浓度依赖性(见图2～3、表3)。

表3 各组间ROS累积、DMT1蛋白表达(n=5)

3 讨论

铁死亡属于一种新型的铁离子依赖性细胞死亡方式，与早期报道[5]的细胞坏死和凋亡等模型有着明显不同。铁死亡对于机体来说是一把“双刃剑”，即其发生在正常细胞中，会因为ROS的过度积累引发多种病症。中枢神经系统疾病中，发现铁死亡是帕金森病中多种细胞死亡方式的一种，在这过程中GPX4发挥着重要的作用[11]。在肿瘤方面，发现顺铂可以引起癌细胞发生铁死亡，其中xCT 和GPX4的表达水平发生了显著变化[12]。于是，在肿瘤细胞中能够诱导铁死亡可能成为肿瘤治疗的一个新方案。

目前，已有研究[13]发现多种药物均可诱导肿瘤细胞发生铁死亡。青蒿琥酯在胰腺癌细胞中可诱导铁死亡的发生；双氢青蒿素也能引发头颈部鳞状细胞癌发生铁死亡[14]；另外，索拉菲尼在治疗肝癌过程中也发现铁死亡的存在[15]。白藜芦醇在抗肿瘤等方面效果显著，并且对大肠癌细胞增殖具有明显的抑制作用[10]。本文研究也发现白藜芦醇对大肠癌SW480细胞增殖表现出时间、剂量依赖性的抑制作用。随着白藜芦醇剂量的增高，SW480细胞中xCT 和GPX4蛋白的表达水平逐渐降低。此外，用流式细胞法检测了不同剂量白藜芦醇处理后SW480细胞中ROS的含量。实验结果发现白藜芦醇处理后SW480细胞中ROS含量显著升高。上述结果充分证实白藜芦醇能诱导SW480细胞发生铁死亡。

细胞发生铁死亡与细胞内铁离子的富集关系密切，DMT1与Cu2+和Fe2+等二价金属离子的转运有一定联系[16]。然而铁死亡本身是因为胞内铁离子的富集导致ROS的过度堆积而引发的细胞死亡。由此不难得出DMT1在细胞铁死亡过程中发挥了重要的作用。为了进一步证实白藜芦醇引发铁死亡的机制是否与DMT1表达有关，实验中对SW480细胞中DMT1蛋白表达水平进行了进一步检测。发现SW480细胞经白藜芦醇处理后，DMT1蛋白表达水平明显升高。总之，本研究发现白藜芦醇早大肠癌SW480细胞中诱导铁死亡，其机制可能与DMT1蛋白表达水平升高有关。