梁 猛

鼻咽癌是一种起源于鼻咽部黏膜上皮的肿瘤，具有明显的区域分布特征，其发生发展是一个多阶段、多途径、多遗传变异、多机制积累的复杂过程，涉及一系列癌基因、抑癌基因及信号通路相关因子改变，寻找影响鼻咽癌发生相关基因，并研究其作用机制，对于鼻咽癌诊疗具有重要意义[1-2]。X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是一个重要的凋亡抑制蛋白，具有明显凋亡抑制作用，有研究[3-4]表明，抑制XIAP表达可促进多种肿瘤细胞凋亡。鼻咽癌中XIAP表达升高，但其对癌细胞生物学特性影响研究尚未明确[5]。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一种细胞因子，参与细胞凋亡、免疫应答等多种途径的调控[6]。已有研究[7-8]表明，TNF-α可诱导包括鼻咽癌在内的多种肿瘤细胞凋亡。因此，本研究通过RNAi技术抑制鼻咽癌细胞XIAP表达，并用TNF-α处理细胞，旨在研究抑制XIAP表达是否可促进TNF-α诱导的鼻咽癌细胞凋亡及降低免疫抑制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人鼻咽癌5-8F细胞购自中国科学院上海细胞库；RPMI 1640培养基和胎牛血清(FBS)均购自美国Gibco；人重组TNF-α购自美国R&D；MTT试剂盒和二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma；流式凋亡检测试剂盒和流式细胞仪均购自美国BD；XIAP、血管内皮生长因子(VEGF)、环氧化酶-2(COX-2)、Cleaved caspase3、Bax、NF-κB p65和 Ikkβ 抗体均购自美国CST；酶标仪购自美国Thermo。siRNA序列由上海生工设计合成。XIAP siRNA sense：5′-GGA GAU ACC GUG CGG UGC UdT dT-3′，anti-sense：5′-AGC ACC GCA CGG UAU CUC CdT dT-3′；阴性对照组siRNA sense：5′-ACA ACT GCC TGG TTG GCA A-3′，anti-sense：5′-TTG CCA ACC AGG CAG TTG T-3′。

1.2 细胞培养 5-8F细胞用含10% FBS的改良型RPMI 1640培养基，在37 ℃、5% CO2及饱和湿度培养箱内常规传代培养。

1.3 分组及siRNA转染 实验分为空白组(细胞不经特殊处理)、TNF-α组(10 ng/mL的外源性TNF-α处理5-8F细胞12 h)、si-XIAP组(si-XIAP转染5-8F细胞48 h)和TNF-α+si-XIAP组(si-XIAP转染5-8F细胞48 h后，使用10 ng/mL的外源性TNF-α处理细胞12 h)。阴性对照siRNA(NC)及XIAP特异性siRNA(si-XIAP)转染参照LipofectamineTM2000说明书。转染前1 d以3×105/孔接种5-8F细胞于6孔板，使转染前细胞达60%～70%融合，将制备的Lipo2000-siRNA复合物加入6孔板，培养箱内常规孵育6 h，更换含血清的培养基，继续培养48 h，Western blotting检测转染后的细胞XIAP表达。

1.4 Western blotting 适量RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法检测总蛋白浓度，总蛋白加上样缓冲液100 ℃煮5 min变性，每孔道上样40 μg，经10%～12%的SDS-PAGE分离，电泳后276 mA转膜2.5 h，取出膜，加5%脱脂奶粉，室温条件封闭1 h，TBST洗膜，加一抗(稀释比例均为1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，加HRP标记的二抗(稀释比例1∶2 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜，ECL显色，暗室下X线胶片显影、定影。Quantity-One软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白与GAPDH灰度值比值为蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.5 MTT法检测细胞活力 以5×103/孔接种5-8F细胞于96孔板，37 ℃培养箱常规孵育过夜，按照1.3实验分组用TNF-α和si-XIAP单独或联合处理5-8F细胞，处理后的每孔细胞加MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，吸去培养上清，每孔加DMSO 200 μL，摇床低速震荡10 min，酶标仪测定490 nm的吸光度值(A490)。实验重复3次。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 以5×105/孔接种5-8F细胞于96孔板，培养箱内常规孵育过夜，按照1.3实验分组用TNF-α和si-XIAP单独或联合处理5-8F细胞，预冷PBS洗涤处理后，胰酶消化细胞，离心，收集细胞，加1×Binding Buffer重悬细胞，之后加5 μL Annexin V-FITC，混匀后再加5 μL PI，混匀，室温避光孵育5～15 min，1 h内通过流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.7 统计学方法 采用方差分析和q检验。

2 结果

2.1 抑制XIAP表达可增加TNF-α诱导的5-8F细胞活力抑制 XIAP siRNA转染5-8F细胞48 h，Western blotting检测XIAP蛋白表达，结果显示，si-XIAP组XIAP 相对表达量为0.097±0.010，明显低于空白组的0.602±0.057(t=15.11，P<0.01)(见图1)。MTT法检测各组细胞活力，结果显示，TNF-α组和si-XIAP组细胞活力均低于空白组(P<0.05)，TNF-α+si-XIAP组细胞活力低于TNF-α组和si-XIAP组(P<0.05)(见表1)。

表1 抑制XIAP表达对TNF-α诱导的5-8F细胞活力抑制的影响

2.2 抑制XIAP表达可促进TNF-α诱导的5-8F细胞凋亡 TNF-α组和si-XIAP组5-8F细胞凋亡率均高于空白组(P<0.05)，TNF-α+si-XIAP组细胞凋亡率高于TNF-α组和si-XIAP组(P<0.05)(见图2、表2)。

表2 抑制XIAP表达对TNF-α诱导的5-8F细胞凋亡的影响

2.3 抑制XIAP表达对TNF-α诱导的5-8F细胞凋亡相关蛋白表达的影响 TNF-α组和si-XIAP组Cleaved caspase3和Bax表达均高于空白组(P<0.05)，TNF-α+si-XIAP组Cleaved caspase3和Bax表达均高于TNF-α组和si-XIAP组(P<0.05)(见图3、表3)。

表3 抑制XIAP表达对TNF-α诱导的5-8F细胞Cleaved caspase3和Bax表达的影响

2.4 抑制XIAP表达对TNF-α诱导的5-8F细胞VEGF和COX-2表达的影 TNF-α组VEGF和COX-2表达均高于空白组(P<0.05)，si-XIAP组VEGF和COX-2表达均低于空白组(P<0.05)；TNF-α+si-XIAP组VEGF和COX-2表达均低于TNF-α组，高于si-XIAP组(P<0.05)(见图4、表4)。

表4 抑制XIAP表达对TNF-α诱导的5-8F细胞VEGF和COX-2表达表达的影响

2.5 抑制XIAP表达对TNF-α诱导的5-8F细胞NF-κB信号通路的影响 TNF-α组NF-κB p65和 Ikkβ 表达均高于空白组(P<0.05)，si-XIAP组NF-κB p65和 Ikkβ 表达均低于空白组(P<0.05)；TNF-α+si-XIAP组NF-κB p65和 Ikkβ 表达均低于TNF-α组，高于si-XIAP组(P<0.05)(见图5、表5)。

表5 抑制XIAP表达对TNF-α诱导的5-8F细胞NF-κB信号通路的影响

3 讨论

研究[9]证实，肿瘤发生发展及演进过程伴有抑癌基因失活、原癌基因激活及参与细胞增殖、凋亡和分化的信号途径失调等。基因治疗正是针对这些特点，将正常基因或有治疗价值的其他基因引入肿瘤细胞，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。因此，寻找影响鼻咽癌发生发展的基因，并研究其机制具有重要意义。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是一类内在的凋亡抑制因子，可通过阻断细胞凋亡所必需依赖的caspases蛋白活性，从而起到细胞凋亡抑制作用，在多种肿瘤中IAPs呈现过表达[10-11]。XIAP是IAPs家族成员之一，已有研究证实XIAP是唯一一个与caspase3、caspase9和caspase7直接结合的凋亡抑制蛋白[12]。且多项研究表明XIAP与肿瘤发生发展密切相关，如microRNA-137可通过调控XIAP促进卵巢癌细胞凋亡[13]，XIAP可通过调控Bcl-2家族损伤肾癌凋亡过程中线粒体功能[14]。XIAP在鼻咽癌中高表达，提高XIAP表达可抑制鼻咽癌细胞凋亡[7]。TNF-α是一个关键的调节分子，参与细胞生长、死亡、分化、炎症等多种重要功能的调控，已被公认为重要的前凋亡因子，可诱导肿瘤细胞凋亡[15]。有研究[16]证实，一些基因可促进或抑制TNF-α诱导的肿瘤细胞凋亡，如沉默RIPK4基因表达可增加TNF-α诱导的骨肉瘤MG-63细胞凋亡敏感性。若XIAP基因可增强TNF-α诱导的鼻咽癌细胞凋亡，这将给鼻咽癌治疗提供很大帮助。本研究通过RNAi技术抑制鼻咽癌5-8F细胞XIAP表达，并用TNF-α处理细胞，发现XIAP表达抑制可增加TNF-α对5-8F细胞活力抑制及凋亡促进作用。提示XIAP同样可增强TNF-α对鼻咽癌凋亡诱导作用，可能是一个有效的鼻咽癌治疗靶点。

NF-κB有广泛的生物学效应，活化的NF-κB因子在癌症发生、免疫调节、细胞生长、炎症反应等过程中发挥重要作用[17]。有实验[18-20]证明，在鼻咽癌、乳腺癌、胶质瘤等多种实体肿瘤中都可检测到NF-κB信号通路的持续高度活化状态。有研究显示，抑制NF-κB信号通路可通过对凋亡及免疫相关因子调控，从而影响肿瘤细胞凋亡及免疫，如阻断皮肤鳞癌细胞中NF-κB信号通路，可下调抑凋亡蛋白Bcl-2表达，上调促凋亡蛋白Bax表达及提高caspase活性[21]；TNF-α在HepG2细胞中能上调凋亡抑制因子VEGF表达，而黄连素能下调由其诱导的VEGF表达，可能是通过NF-κB信号通路所介导[22]；黄芩素可抑制TNF-α诱导的宫颈癌细胞NF-κB信号及其下游靶基因免疫抑制因子COX-2表达[23]。肿瘤细胞对TNF-α的反应主要由NF-κB来介导，TNF-α可激活NF-κB信号通路，而活化的NF-κB信号可拮抗TNF-α诱导的细胞毒性[24]。有研究[25]显示，抑制XIAP可增强TNF-α诱导的乳腺癌细胞凋亡及下调NF-κB信号通路。本研究结果显示，抑制XIAP表达可上调TNF-α诱导的细胞Bax、Cleaved caspase3表达，下调VEGF、COX-2、NF-κB p65和IκBα表达。提示抑制XIAP表达可通过下调NF-κB信号通路诱导鼻咽癌细胞凋亡及降低免疫抑制。

综上所述，下调XIAP基因表达可增强TNF-α诱导的鼻咽癌5-8F细胞凋亡及降低VEGF和COX-2表达，机制与抑制NF-κB信号通路有关。该研究提示XIAP可能是鼻咽癌诊疗的有效靶点之一。