涂远航，李珊珊，陈 策，丁秀丽

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性流行，全球约有2.57亿慢性HBV感染者。亚洲多数地区为中至高流行区[1]。据估计，每年大约有 100 万人死于HBV相关的并发症。因此，积极探索HBV 持续性感染的机制，有助于建立更有针对性的治疗方法，从而清除慢性感染者体内HBV。目前普遍认为，T淋巴细胞介导的细胞免疫对HBV的清除起关键作用[2]，但T淋巴细胞的活化需要共刺激分子及其配体的正常表达，异常的共刺激信号影响慢性乙型病毒性肝炎病人的免疫应答[3]。目前，研究较为广泛、 深入并取得重要进展的协同刺激分子是CD28家族成员，CD28家族成员包括CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4、BTLA，其中CD28 和 ICOS 对于T淋巴细胞的活化起关键作用。目前，CD28和ICOS在人类HIV 感染中的研究最为广泛和深入[4-5]，但在慢性乙型病毒性肝炎中的研究报道相对较少。因此，本研究通过观察慢性乙型病毒性肝炎病人外周血中CD28、ICOS 分子的表达，分析其与HBV持续感染及病情进展的关系，以期为临床治疗慢性乙型病毒性肝炎提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2017年3月至2019年8月蚌埠医学院第二附属医院感染科及解放军902医院肝病中心收治的慢性乙型病毒性肝炎住院病人56例作为观察组，另纳入同期20名健康体检者作为对照组，2组一般资料均具有可比性。慢性乙型病毒性肝炎诊断以中国《慢性乙型肝炎防治指南(2015年)》 作为标准。排除合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染及自身免疫相关疾病，入院前均未接受过抗病毒和免疫治疗。

1.2 实验方法

1.2.1 外周血单个核细胞的采集和保存 所有受试者均清晨空腹采集外周血10 mL，室温下 EDTA 抗凝，及时(6 h 内)行流式细胞术检测。

1.2.2 流式细胞术分析 采用Epics XL型流式细胞仪检测外周血CD4+、CD8+T细胞，以及CD4+、CD8+T 细胞中 CD28、ICOS的表达水平，采用Kaluza Analysis软件分析各细胞亚群的比例(CD4%、CD8%、CD4+CD28+%、CD8+CD28+%、CD4+ICOS+%、CD8+ICOS+%)。流式细胞仪及分析软件均为美国Beckman coulter公司产品；检测试剂由解放军902医院肝病中心实验室提供。

1.3 统计学方法 采用t检验。

2 结果

2.1 2组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞水平 2组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞及CD4+/CD8+差异均无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 2组外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞水平比较

2.2 T淋巴细胞表面CD28的表达水平 观察组外周血CD4+CD28+T 细胞、CD8+CD28+T 细胞水平均明显低于对照组(P<0.01)(见表2)。

表2 2组外周血不同T淋巴细胞表面CD28的表达水平比较

2.3 T淋巴细胞ICOS的表达水平 2组CD4+ICOS+T细胞水平差异无统计学意义(P>0.05)；观察组CD8+ICOS+T细胞水平明显高于对照组(P<0.01)(见表3)。

表3 2组外周血不同T淋巴细胞表面 ICOS 的表达水平比较

3 讨论

人体感染HBV后，会出现两种情况，一种是机体特异免疫被激活，病毒被清除；另一种是机体长期携带病毒，免疫与病毒共存，造成持续慢性感染[6]。HBV能否被有效清除，T细胞介导的细胞免疫起重要作用[7-8]，但T细胞的激活需要双信号，单纯的T细胞表面受体-抗原肽-MHC分子的相互作用并不能诱导T细胞的活化，还需要 CD28、ICOS 、CD137等协同刺激受体[9]，CD28、ICOS通过激活磷脂酰肌醇3-激酶等途径，影响细胞因子的合成和存活[10]，同时促进T细胞活化、白细胞介素等细胞因子的生产，并发挥免疫效应[11]。

正常情况下，机体CD4+和CD8+T淋巴细胞比例稳定在一定水平，以维持机体免疫功能稳态，但HBV感染会打破这种平衡。近些年，国内外对慢性乙肝外周血T淋巴细胞亚群研究较多，但报道的结果并不一致。黄云丽等[12]对144例乙肝病人T淋巴细胞亚群分析发现，从急性乙型病毒性肝炎、慢性乙型病毒性肝炎到乙型病毒性肝炎导致的肝硬化病人CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞计数呈现逐渐减少趋势，肝硬化组CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞计数均少于急、慢性乙肝组及正常对照组。吴昊等[13]研究果表明，随着慢性乙肝病情的发展，CD3+、CD4+T淋巴细胞绝对数有明显减少趋势，而CD8+T淋巴细胞在慢活肝组中并不降低；孙永年等[14]研究则发现慢性乙肝及肝硬化组CD8+T淋巴细胞高于正常对照组。由于现有的研究结果不一致，无法确定HBV 持续性感染是否与CD4+、CD8+T淋巴细胞数量下降或两者比例异常有关，因此本研究观察了CD4+、CD8+T淋巴细胞数量及比例，结果显示，慢性乙型肝炎组CD4+和CD8+T淋巴细胞及两者间的比例与健康对照组差异无统计学意义。既然慢性乙肝病人的CD4+和CD8+T淋巴细胞数量及比例未出现异常，那么CD4+和CD8+T淋巴细胞是否存在功能上的缺陷呢？本研究进一步观察共刺激分子CD28及ICOS在T细胞上的表达情况，发现CD28分子在慢性乙肝病人外周血中CD4+和CD8+T淋巴细胞的表达明显下降，这提示相当一部分T淋巴细胞由于缺乏共刺激信号不能被激活，而只能处于无功能状态或进入凋亡[15-16]。而ICOS在两个不同T细胞亚群中的表达与CD28并不一致，ICOS在慢性乙肝病人CD8+T淋巴细胞上表达明显增高，甚至高于健康对照组，而在CD4+T淋巴细胞上并未发现明显上调。尽管ICOS与CD28同属于CD28 家族成员，但两者亦存在很大差异。CD28表达于T细胞表面，主要为T细胞激活提供必要的信号，而ICOS则表达于已经活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞表面，与其配体ICOSL相互作用，促进T细胞分泌大量细胞因子，包括IL-4、IL-5、IL-10、γ-干扰素等[17-18]。本研究中，ICOS在CD4+和CD8+T淋巴细胞的这种差异化表达，可能会导致CD8+T异常激活甚至出现功能亢进，而CD4+T淋巴细胞因缺乏足够的协同刺激信号，功能则相对较弱，其结果与CD4+和CD8+T淋巴细胞比例失衡相似，这种细胞功能上的失衡同样会导致HBV难以清除；同时由于ICOS在CD8+T淋巴细胞上的过度表达，会导致CD8+T细胞功能亢进，诱发肝组织反复、持续炎症，导致肝组织病变逐渐加重。

综上，慢性乙型肝炎病人同时存在免疫低下和免疫紊乱。免疫低下主要与T淋巴细胞表面CD28表达减少有关，而免疫紊乱则主要由ICOS在CD4+、CD8+T淋巴细胞上的不均衡分布所致。免疫低下导致HBV持续感染、难以清除；免疫紊乱则导致慢性HBV病人出现持续的肝组织损伤。因此如何提高慢性乙型肝炎病人T淋巴细胞表面CD28的表达，同时避免ICOS在不同淋巴细胞亚群的不均衡分布，对于清除HBV、减轻肝组织损伤具有重要意义。