于秀冰 丁保锋 刘全成

黑龙江省佳木斯市中心医院 1 病理科 2 肿瘤外二科 3 麻醉科 154002

乳腺癌是发生于女性的常见恶性肿瘤，该病常见的症状是乳腺肿块，其次为腋下淋巴结肿大，严重影响女性的身心健康[1]。但是有些乳腺癌患者发现肿块时已有远处的转移，失去最佳治疗时间，故如何提高乳腺癌的诊断水平，改进乳腺癌的治疗方法成为新的研究热点[2]。鼠双微体基因2(MDM2)是功能及其复杂的一种蛋白，对肿瘤的发生、发展、肿瘤细胞的侵袭和迁移有影响，其过表达增加肿瘤的侵袭[3]。同时有研究报道[4]，血管内皮生长因子(VEGF)在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用，可通过多种途径影响着肿瘤的侵袭和转移；微血管密度(MVD)直接反映癌组织中新生微淋巴管和微血管的活跃程度。鉴于此，本文为分析MDM2在乳腺癌组织中表达及与MVD、VEGF相关性，选取60例乳腺癌患者进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020年4月—2021年4月我院收治的60例乳腺癌患者作为研究对象。患者年龄35～56岁，平均年龄(45.15±10.05)岁；肿瘤直径1.5～4.5cm，平均肿瘤直径(3.03±1.02)cm；TNM分期：Ⅰ期2例、Ⅱ期19例、Ⅲ期28例、Ⅳ期11例；组织学类型：黏液癌2例、导管内癌4例、浸润性小叶癌4例、乳头状腺癌6例、浸润性导管癌44例。纳入标准：(1)符合行手术治疗指征，且术后苏木精—伊红(HE)染色法确诊为乳腺癌患者；(2)原发且术前未行抗肿瘤治疗者；(3)知情本次研究者。排除标准：(1)合并其他肿瘤者；(2)合并其他严重疾病者；(3)术前经放疗、化疗治疗者；(4)意识、精神、听觉、视力障碍者。本次研究获得我院伦理委员会的认证。

1.2 试剂及药品 鼠抗人MDM2单克隆抗体、兔抗人VEGF单克隆抗体均购于北京奥博星生物技术有限责任公司。SP试剂盒、二氨基联苯胺(DBA)显色试剂盒均购于北京杰辉博高生物技术有限公司。

1.3 方法 (1)样本采集：取手术切除乳腺癌组织为观察组，取癌旁正常组织为对照组(切取自距离肿瘤组织≥5cm处，病理检查证实为正常肺组织)。(2)样本制作：选取目标部位，用福尔马林溶液(浓度为100mmol/L)固定24h后修整组织块，然后依次放入AF液12h、70%酒精和80%酒精各6h、95%酒精Ⅰ12h、95%酒精Ⅱ1h、100%酒精Ⅰ和100%酒精Ⅱ各1.5h，松节油Ⅰ、松节油Ⅱ、浸蜡Ⅰ各15min，浸蜡Ⅱ3.5h，包埋处理备用。(3)免疫组化(SP法)：①切片经二甲苯脱蜡(15min×3次)， 梯度酒精(100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%Ⅰ、95%Ⅱ各5min)，PBS冲洗5min。②30%H2O2与蒸馏水(1∶10)混合，在20℃下孵育15min，蒸馏水洗3次。③热修复抗原：把切片放入pH 6.0枸橼酸盐缓冲液中加热至沸腾，间隔5min后再加热至沸腾。冷却后PBS(pH 7.2～7.6)洗涤1～2次。④滴加适当比例PBS稀释的一抗。⑤滴加生物素标记的二抗，在37℃下孵育30min，用PBS冲洗3次。⑥DAB显色。⑦苏木精复染1min，用蒸馏水充分洗涤，再用1%盐酸分化2s，至水，2%氨水5s，至水。脱水(70%酒精、80%酒精、90%酒精各5min，100%Ⅰ酒精、100%Ⅱ酒精各10min)，透明(二甲苯5min×2次)，封片。(4)结果判定[5]：高倍镜下取5个不同视野各计数100个细胞，MDM2阳性细胞：细胞内出现淡黄至棕褐色颗；MVD阳性细胞：内皮细胞着色棕黄色；VEGF阳性细胞：胞质或胞膜中呈现棕黄色颗粒。

2 结果

2.1 两组MDM2、MVD、VEGF阳性表达水平比较 观察组的MDM2阳性率、MVD阳性率、VEGF阳性率明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组MDM2、MVD、VEGF阳性表达水平比较[n(%)]

2.3 乳腺癌组织中MDM2表达量与MVD、VEGF表达量的相关性 经Spearman秩相关检验分析发现，乳腺癌组织中MDM2表达量与MVD、VEGF表达量呈正相关性。详见表2。

表2 乳腺癌组织中MDM2表达量与MVD、VEGF表达量的相关性

3 讨论

随着对乳腺癌的深入研究，临床研究发现[6]，乳腺癌的发生与年龄、生育情况、激素水平、社会环境因素及遗传等密切相关，其中遗传因素是一重要机制，抑癌基因的异常甲基化通过沉默抗增殖、抗凋亡、抗血管生成和DNA修复等基因的活性致使其正常生理功能缺失从而在肿瘤的发生中具有重要的作用。

VEGF在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。一方面能够迫害肿瘤侵袭的天然屏障，为肿瘤的浸润和转移创造条件。另一方面能够提高血管通透性，刺激血管内皮细胞增加，为毛细血管芽延伸生长提供良好的基质。并且新生血管能够促进肿瘤发生、浸润、转移，而MVD则是直接反应新生微淋巴管和微血管的活跃程度[7]。同时MDM2参与调节细胞增殖和凋亡相关的信号通路，发挥P53非依赖的生物学活性，且与预后不良相关[8]。

MDM2、VEGF、MVD均在肿瘤的多步骤演进中起重要作用，其潜在的理论机制尚不清楚。为进一步探讨MDM2与VEGF、MVD之间的关系，选取60例乳腺癌患者进行研究，结果发现，观察组的MDM2阳性率、MVD阳性率、VEGF阳性率明显低于对照组。经Spearman秩相关检验分析发现，乳腺癌组织中MDM2表达量与MVD、VEGF表达量呈正相关性。分析原因，MDM2是一个功能极其复杂的蛋白，具有转录因子活性、可介导蛋白质—蛋白质作用，也能与DNA和RNA作用，能够调节细胞生长，在调控细胞增殖、凋亡过程中起关键作用，而且其高表达与肿瘤侵袭转移有高度的相关性，参与癌细胞的侵袭和迁移。而肿瘤细胞的生长与血液中营养物质的供应密切相关，而新生淋巴管道和血管无疑为肿瘤细胞的转移提供了更多途径，VEGF可刺激血管内皮细胞的增殖，促进肿瘤细胞生长和转移；MVD能够增加微淋巴管和微血管的数量，提高应用物质的供应。

综上所述，乳腺癌组织中MDM2的表达水平与MVD、VEGF表达量密切相关，可作为乳腺癌的诊断标志物。