龙汝沛 文育锋 李文博 张 冉 汪玉琴

1 皖南医学院，安徽省芜湖市 241001； 2 安徽卫生健康职业学院

步入21世纪，心血管病(Cardiovascular diseases，CVD)已成为我国乃至全世界人民健康的头号杀手。《中国心血管病报告2017》报告指出，我国心血管类疾病因社会老龄化逐渐加重，居民普遍存在的不良生活方式如吸烟饮酒、身体活动不足、不合理膳食等原因，患病率和死亡率都居高不下，而且在今后仍处不断上升阶段。据推算我国CVD 2018年患病人数达2.9亿人，患病人数前四位依次为：高血压、脑卒中、冠心病、肺源性心脏病。2015年CVD死亡率超过恶性肿瘤等其他人类疾病居于各类疾病首位，心血管疾病的三高，即高患病率、高死亡率以及极高的医疗负担为我国疾病防治工作带来了严峻的挑战[1]。动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种以脂质代谢障碍为病变基础累及全身大小动脉的疾病，其最突出的病理机制为动脉粥样斑块附着于动脉血管内壁，使动脉腔变狭窄，或继发血栓形成阻塞血管，使相应的器官供血不足甚至缺血坏死，从而引起全身性的疾病。

流调结果表明绝经前后女性人群高血压等心血管类疾病发病率有明显的变化，绝经前低于同年龄组的男性，但是绝经后发病率飞速上升，甚至高于同年龄段的男性。绝经后女性生理上最主要的改变是雌激素水平的显著下降，研究显示雌激素下降与心血管类疾病事件发生相关联。维生素D是一种脂溶性维生素，人体所需的维生素D大多数通过光照作用机体自然合成，并且在较小程度上来源于天然含有维生素D的食物补充。有研究发现维生素D可通过一系列复杂的机制调节肾素—血管紧张素系统而影响血压变化，而高血压是CVD的独立危险因素。也有研究显示维生素D与多种CVDS相关，维生素D受体广泛存在于血管细胞、血管内皮细胞、心肌细胞，且调节肾素血管紧张素醛固酮系统产生积极影响，但是具体的机制仍不清楚。但临床试验和流调结果显示补充维生素D是否能预防动脉粥样硬化性疾病仍然存在较大争议[2-4]。

在复制实验动脉粥样硬化模型时，诸多试验表明高剂量维生素D能够促进实验动物动脉硬化模型的形成[5-7]。但低剂量加入维生素D是否能影响动脉硬化的形成鲜有研究。本次实验通过研究低剂量补充维生素D对卵巢切除大鼠动脉粥样硬化相关血液指标的影响,为探索绝经后妇女补充维生素D对防治动脉粥样硬化性疾病是否有影响寻找依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 于南京市玄武区诺伊特生物技术中心购买42只3月龄SD未孕雌性大鼠,体重150～200g,平均体重(167.80±14.58)g，放于动物房饲养1周后随机分成对照组、卵巢切除组、维生素D组,每组14只。

1.2 药物及试剂 维生素D胶囊型滴剂(芜湖市中山大药房)、食用油(芜湖市欧尚超市)、注射用牛血清蛋白(BAS，南京市玄武区诺伊特生物技术中心)、高脂饲料(南京市玄武区诺伊特生物技术中心)、各血清指标酶联免疫试剂盒(合肥碧信生物科技有限公司)。

1.3 造模及给药方法 对照组:行伪手术(从背部切口1cm暴露双侧卵巢[8],不予摘除,双侧缝合注射青霉素抗感染)和普通饮食，灌胃生理盐水2.5ml/d；卵巢切除组、维生素D组大鼠从背部切口摘除双侧卵巢形成去势模型。去势手术恢复1周后一次性注射牛血清蛋白(BSA)250mg/kg。之后卵巢切除组、维生素D组给予高脂饲料饲养10周。卵巢切除组每日灌服生理盐水2.5ml,维生素D组取VitD 15IU溶于2.5ml食用油灌喂。

1.4 标本采集 为得到可靠血脂相关指标，大鼠先禁食12h后麻醉,剖开腹腔,用一次性注射器取腹主动脉血,装于试管中,分组做好标记,静置15min，3 000r/min高速离心法分离，制备大鼠血清，放置于-80℃冰箱中保存待检。取大鼠肝脏组织，分离各组大鼠胸主动脉放于福尔马林试剂中保存，待做组织切片。

1.5 标本测定及切片制作 用酶联免疫分析(ELISA)方法检测大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、C反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等指标。检测地点是皖南医学院药理实验室。肝脏以及胸主动脉HE染色制作组织切片，观察形态学改变。切片制作地点皖南医学院组胚实验室。

2 结果

2.1 维生素D干预后血脂及炎症因子的变化 卵巢切除组通过免疫损伤联合高脂饮食11周后血清指标TC、TG、CRP、IL-6、TNF-α、HDL-C、LDL-C 7项血液指标均高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)；卵巢切除组TC、TG、CRP、IL-6、TNF-α、HDL-C与维生素D组无显著差别(P>0.05)；卵巢切除组LDL-C低于维生素D组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血脂及炎症因子水平比较

2.2 大鼠肝脏HE染色切片观察结果 图1显示对照组肝细胞大小正常，形态规则，排列有序，肝小叶清晰，肝细胞内未出现可见的脂肪颗粒，胞浆染色浅且均匀。图2显示卵巢切除组肝细胞排列较紊乱，大小较图1欠规则，形态不规则，细胞整体染色较图1偏深，细胞核突出，肝小叶模糊，肝细胞内出现肉眼可见明显的脂肪空泡。图3显示维生素D组肝细胞排列紊乱，大小形态欠规则，细胞染色最深，细胞核明显，肝小叶异常，肝细胞中存在大量明显可见的脂肪空泡。

图1 对照组肝脏切片图(400×)

图2 卵巢切除组肝脏切片图(400×)

图3 维生素D组肝脏切片图(400×)

2.3 大鼠胸主动脉HE染色切片观察结果 图4显示对照组平滑肌纤维排列正常，内皮较完整，内膜没有出现明显增厚，内腔无向内凸起的纤维斑块。图5显示卵巢切除组平滑肌排列正常，但内皮不完整，内膜有明显增厚，腔内形成凸起纤维斑块。图6显示维生素D组平滑肌排列正常，内皮不完整，内膜明显增厚，内腔有明显向内凸起纤维斑块，有肉眼可见明显的纤维帽形成。

图4 对照组胸主动脉切片图(400×)

图5 卵巢切除组胸主动脉切片图(400×)

图6 维生素D组胸主动脉切片图(400×)

3 讨论

25(OH)D是维生素D在肝脏中通过羟基化作用转化而来，由于其半衰期较长是人体中维生素D最主要的储存形式，也是监测人体中维生素D水平最良好的一个反映指标。 目前评价人体中维生素D缺乏与否的指标尚未取得统一的标准，一般认为：25(OH)D<15ng/ml(35nmol/L)为缺乏，15～29ng/ml(35～68nmol/L)为不足，>30ng/ml(70nmol/L)为充足。研究显示在动脉粥样硬化形成的病理过程中免疫炎症反应是病变形成的一个关键环节，在一项大规模的队列研究中发现CRP、IL-6等炎性因子与25(OH)D水平呈负相关。因为生活方式的改变，人们户外活动时间的减少，维生素D缺乏已经成为一个普遍存在和备受关注的公共健康问题，并且研究发现女性缺乏状况较男性更加严重。体内的雌激素通过增加脂蛋白脂酶的活性，分解血浆TG；调节线粒体功能，对氧化应激反应起保护作用；调节脂肪细胞因子，增加瘦素敏感性，降低脂联素，调节体内血脂水平，对心血管系统有直接的保护性作用；女性在进入绝经期后由于卵巢功能进行性衰退、雌激素水平下降等原因心血管疾病以及血脂代谢异常的发病率会增加。而越来越多的研究表明维生素D与血脂代谢之间存在密切联系，但结果尚存在争议。

近年来关于维生素D是否具有保护心血管疾病的作用有诸多研究，但是结果尚存在争议。根据美国一项循证医学研究，全国共25 871名参与者，随机分为安慰剂组和实验组，中位随访5.3年，研究结果补充维生素D与主要的降低心血管事件如心肌梗死、卒中等主要死亡终点的风险无关[9]。根据英国学者一项研究成年人补充钙剂和/或维生素不增加患心肌梗死、缺血性心脏病或心血管疾病的风险[10]。根据2017年4月《美国医学会杂志心脏病学》研究发现每月1次高剂量每日高剂量补充维生素D对心脏疾病并无预防作用，先前也有研究显示低剂量补充维生素D对心脏疾病同样并无预防作用[11]。但国内外也有研究表明，适量补充维生素D有可能可以阻止动脉粥样硬化的发生[12]，而维生素D缺乏在动脉粥样硬化的形成中具有潜在的风险[13]。维生素D信号通路尚在研究当中，可能可以解释这两种结果的差异。

研究显示维生素D3可通过一系列生理机制促进机体对钙和磷的吸收，大剂量的维生素D3可使钙离子在动脉内膜下沉积使动脉发生钙化。所以许多研究以大剂量的一次性或分次补充维生素D或者维生素D3，作为诱导剂建立动物动脉硬化模型的一种标准有效的实验方法。本次实验研究结果显示，卵巢切除组TC、TG、LDL-C、HDL-C等较对照组大鼠血液指标有显著差异，卵巢切除组大鼠血脂水平升高。卵巢切除组大鼠内膜出现明显的动脉硬化斑块，且炎症反应指标CRP、IL-6、TNF-α较对照组明显升高，提示卵巢切除组出现明显免疫炎症修复反应。有研究表明，代谢损伤与PCSK9表达有关，PCSK9与LDLR结合促进其降解导致代谢损伤。卵巢切除后的大鼠PCSK9的表达下降，引起LDLR表达升高，导致血浆LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α水平升高[14]。对照组肝脏、胸主动脉切片观察结构正常，卵巢切除组肝脏组织出现脂肪肝，胸主动脉观察到明显的动脉硬化样内膜改变，和血液检测结果相符合，动脉硬化模型建立成功。维生素D组与卵巢切除组比较TC、TG、CRP、IL-6、TNF-α、HDL-C均无显著差别，但维生素D组LDL-C较卵巢切除组高，组织切片观察肝脏出现更多的肝细胞脂肪空泡，且胸主动脉也出现明显的动脉硬化斑块。本实验结果表明，补充维生素D会引起LDL-C水平升高，加速动脉硬化进程。

本实验动脉粥样硬化相关的CRP、IL-6、TNF-α卵巢切除组与维生素D组中均无统计学差别，且维生素D组也出现血脂升高，肝细胞、胸主动脉病变，提示大鼠长期低剂量补充维生素D可能不是动脉粥样硬化保护性因素。本次实验结果提示：绝经后妇女单纯性补充维生素D可能不具有预防和治疗动脉粥样硬化性疾病的作用。