孟 涛，曾祥岳，金 博

（新疆医科大学附属肿瘤医院胃肠外科,乌鲁木齐 830011）

胃癌在中国胃肠道肿瘤中排名第一，对人类健康构成严重威胁[1-2]。目前，手术仍是早期胃癌患者的主要治疗方法[3]。但是，胃癌的早期诊断率很低，大多数患者在被诊断时已经处于中晚期，目前针对中晚期胃癌患者的治疗仍然没有取得明显的进展[4-5]。因此，探索新型胃癌治疗手段仍然是胃癌治疗中需要解决的关键问题。众所周知，胃癌干细胞（GCSC）具有自我更新能力，还有致瘤性和驱动耐药性的特征[6-7]，并且可能具有驱动肿瘤异质性和肿瘤生长的功能[8]。GCSC 不仅负责免疫逃逸，而且还负责免疫抑制，维持与肿瘤相关的巨噬细胞以及调节性T 细胞生长以抑制免疫介导的肿瘤清除[9]。目前，已确定了几种分子作为GCSC的标志物，包括Lgr5、CD44、CD133、醛脱氢酶（ALDH）等[10]。靶向消除GCSC被认为是一种非常有前景的胃癌治疗方向[11]。先前有研究表明，基于肿瘤干细胞裂解物的疫苗可以提供大量肿瘤特异性抗原，刺激免疫细胞的增殖和分化，并克服癌症疫苗弱免疫原性的缺陷[12]。本研究旨在构建针对胃癌干细胞的肿瘤疫苗，探索其是否可以引发足够的抗肿瘤免疫反应，从而抑制体内胃癌细胞的生长。

1 材料和方法

1.1 细胞系及主要试剂

小鼠胃癌细胞系MFC 细胞及小鼠淋巴瘤细胞系YAC-1 购自武汉普诺赛生物科技有限公司。两种细胞系均用Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 完全培养基培养，培养基中含有10%胎牛血清，1%青霉素/链霉素/谷氨酰胺。

表皮生长因子和成纤维细胞生长因子，购自北京义翘神州生物科技有限公司；RNA 提取试剂盒，购自南京翼雪飞生物科技有限公司；cDNA 逆转试剂盒和SYBR Green Mix，购自上海翌圣生物科技有限公司；小鼠自然杀伤细胞（NK 细胞）分离试剂盒和小鼠细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）分离试剂盒，购自STEM CELL公司（加拿大）；红细胞裂解液、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）、7AAD，购自Ivitrogen公司（美国）；兔抗鼠GzmB抗体和兔抗鼠Perforin抗体，购自Abcam 公司（美国）；山羊抗兔HRP 偶联二抗、白介素（IL）-1β、IL-2、IL-4 和IL-12 ELISA 检测试剂盒，购自杭州联科生物科技有限公司。

1.2 胃癌干细胞的富集

将约2×105MFC 细胞接种到超低吸附6 孔板（Corning，美国）中，培养基选择为无血清RPMI1640培养基，额外添加20 μg/L表皮生长因子，20 μg/L成纤维细胞生长因子和1%青霉素/链霉素/谷氨酰胺，在5%CO2培养箱中于37 ℃下培养。培养14 d 后，收集肿瘤球，即为胃癌干细胞，其他未形成小球的细胞用胰酶消化收集，即为普通肿瘤细胞。

1.3 克隆形成实验

将约500 个单细胞接种在6 孔板中，添加2 mL培养基，然后在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。在第14 天使用0.1%结晶紫溶液在室温下避光染色30 min，用冷PBS冲洗3次后风干，对菌落数进行记数。

1.4 qPCR检测肿瘤干细胞标记物的表达

使用RNA 提取试剂盒提取总RNA 用于qPCR。根据制造商的方案，使用cDNA逆转试剂盒对RNA进行逆转，之后使用qPCR SYBR Green Mix进行qPCR。qPCR 在Step One Plus 实时系统（Applied Biosystems，美国）上进行。循环条件为：95 ℃初始热活化2 min，2 步循环；95 ℃变性5 s，60 ℃退火/延伸10 s。循环数为40。倍数变化值的计算公式为2-ΔΔCt。引物为：CD44（F:5′-CGTGCTGGGAGGCAGAATA-3′,R:5′-GGGCATCCTTGGTCTGTTTG-3′）,Lgr5（F:5′-CTGGCAGTGGAAGCGTCATA-3′,R:5′-TCTCTGTTTTCATTAGCAGAGACAT-3′）,GAPDH（F:5′-GCCTTCCGTGTTCCTACC-3′,R:5′-GCCTGCTTCACCACCTTC-3′）。引物由安徽通用生物合成。

1.5 GCSC 疫苗免疫小鼠模型检测对肿瘤生长的抑制能力

18只6周龄的雌性Balb/c小鼠购自新疆医科大学实验动物中心。所有小鼠均按照我院伦理学的规章饲养在特定的无病原体设施中。实验组包括PBS 组、WT 疫苗组、GCSC 疫苗组。疫苗是通过反复冻融法制备，将2×105GCSC 或WT cell 于-80 ℃冷冻30 min，并于37 ℃解冻30 min，重复3次。之后所有小鼠均在右侧腹部皮下免疫2×105个疫苗细胞，共进行3 次，每次间隔7 d。最终疫苗接种后1周，皮下注射2×106个野生型MFC细胞。每5 d监测1 次小鼠的肿瘤体积。肿瘤体积计算为（长×宽×高/2）mm3。

1.6 流式检测NK细胞和CTL的细胞毒性

在疫苗免疫后的第35 天，获取小鼠脾脏，分离小鼠脾细胞，并用红细胞裂解液裂解红细胞。脾细胞使用5 μmol/L CFSE 在37 ℃孵育30 min，之后用预冷的PBS 终止。按照制造商的说明，使用小鼠NK细胞分离试剂盒和小鼠CTL分离试剂盒获取小鼠的NK 细胞和CTL。分别取5×105个NK 细胞或CTL与1×105YAC-1细胞在37 ℃下共孵育24 h。收集YAC-1 细胞并用PBS 洗涤3 次。随后，所有样品在室温下用7AAD 染色15 min。通过流式细胞仪（贝克曼，美国）分析样品，并使用FlowJo X 软件进行分析。

1.7 ELISA检测血清中IL-1β、IL-2、IL-4和IL-12的含量

在疫苗免疫后的第35 天，获取小鼠血清200 μL。根据制造商的方案，使用IL-1β、IL-2、IL-4 和IL-12 ELISA 检测试剂盒检测血清中细胞因子的含量。

1.8 免疫组化检测肿瘤组织中GzmB和Perforin的含量

肿瘤组织在4%多聚甲醛中固定48 h，并储存在70%乙醇中，直到进一步处理。IHC 由武汉塞维尔生物技术有限公司操作。5 mm石蜡切片在5%山羊血清中封闭1 h，使用兔抗鼠GzmB 抗体（1∶500）和兔抗鼠Perforin（1∶500）抗体在4 ℃下孵育过夜，之后使用山羊抗兔HRP 偶联二抗（1∶1 000）室温孵育1 h。DAB 显色后用苏木精复染2 min，使用Nanosomer2.0HT 数字载玻片扫描仪和NDP.view2 软件（Hamamatsu）获得图像。

1.9 统计学方法

采用SPSS 19.0 软件对数据进行统计处理。计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鉴定胃癌干细胞的特征

克隆形成实验的结果表明，GCSC 较WT cell会形成更多的克隆小球（P＜0.05）（图1A、B）。qPCR 结果显示，GCSC 中肿瘤干细胞标记物CD44 和Lgr5 的表达量较WT cell 明显升高（P＜0.001，P＜0.01）（图1C、D）。

图1 鉴定GCSC特征

2.2 GCSC疫苗抑制小鼠胃癌细胞的生长

经过3次疫苗免疫后，对小鼠皮下接种MFC细胞（图2A）。结果显示，GCSC 疫苗较WT 疫苗更能显著抑制小鼠体内的肿瘤生长（P＜0.05）（图2B）。对解剖后的肿瘤进行拍照称重，结果也表明，GCSC疫苗组的肿瘤质量显著低于WT 疫苗组（P＜0.000 1）（图2C、D）。

图2 GCSC疫苗的肿瘤抑制能力

2.3 GCSC疫苗增强NK细胞和CTL的细胞毒性

流式检测结果显示，GCSC疫苗组小鼠NK细胞的细胞毒性显著强于WT 疫苗组和PBS 组（P＜0.05）（图3A、B）。与PBS 组比较，GCSC 疫苗组小鼠CTL的细胞毒性也显著升高（P＜0.05）（图3C、D）。

2.4 GCSC 疫苗提高免疫小鼠外周血中细胞因子的水平

ELISA 检测小鼠血清中细胞因子的含量，结果表明，GCSC 疫苗组小鼠血清中IL-4、IL-2 和IL-12水平较WT疫苗组和PBS组显著升高（P＜0.05，P＜0.01）（图4B、C、D），而IL-1β的含量在3组小鼠中无显著差异（P＞0.05）（图4A）。

图4 GCSC疫苗诱导的血清中的炎性因子

2.5 GCSC疫苗显著提高肿瘤组织中GzmB和Perforin的含量

免疫组化结果显示，GCSC 疫苗组小鼠肿瘤组织中GzmB 和Perforin 的表达水平较WT 疫苗组和PBS 组显著升高（P＜0.000 1），表明其具备更强的抗肿瘤免疫反应，见图5。

图5 GCSC疫苗在肿瘤组织中诱导的GzmB和穿孔素表达

3 讨论

胃癌的高复发率和高死亡率问题仍未解决，这可能与胃癌干细胞的生物学特性密切相关[13]。因此，胃癌干细胞被认为是非常有希望的治疗靶标。最近的研究发现，疫苗可以作为靶向清除肿瘤干细胞的有效策略，这主要是通过提供足量的肿瘤特异性抗原，进而引发机体强烈的抗肿瘤免疫反应实现的[14]。在本研究中，我们发现GCSC 疫苗通过对胃癌干细胞的靶向杀伤作用显著降低肿瘤的生长。

目前常用的癌症疫苗包括肿瘤裂解物、肿瘤相关抗原多肽疫苗以及树突状细胞疫苗[15]。已经证明，与肿瘤相关抗原多肽疫苗相比，整个肿瘤细胞的裂解物是一种更好的抗原来源，能够诱导更加充分的抗肿瘤免疫反应[16]。有多种制备肿瘤细胞裂解物的方法，包括冻融、加热、次氯酸氧化和UVB 照射[17]。冻融方法可能导致肿瘤细胞坏死，增加肿瘤抗原的释放[18]，因此本研究也采用了冻融法制备胃癌干细胞疫苗。Ning 等[19]揭示基于肿瘤干细胞裂解物的疫苗可以在黑色素瘤小鼠模型中诱发产生IgG 抗体和特异性细胞毒性T 细胞。同样，在本研究中也发现，注射GCSC 疫苗的小鼠中，NK 细胞和细胞毒性T淋巴细胞的杀伤能力显著增强，同时，体内细胞因子IL-2，IL-4 及IL-12 的含量明显增加，这些都表明GCSC疫苗有效的引发了小鼠体内的抗肿瘤免疫反应。Todaro等[20]先前的报道发现，CD133+结直肠癌肿瘤干细胞可以被细胞毒性T淋巴细胞通过穿孔素和颗粒酶杀死，在本研究中，给予GCSC疫苗干预的小鼠肿瘤组织中GmzB 和Perforin 的含量显著高于PBS 组，这也证明了GCSC 疫苗引发了细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。

有研究结果表明，肿瘤干细胞DC疫苗在SCC7鳞状细胞癌和D5黑色素瘤小鼠模型中均显著抑制肿瘤的复发和转移，使用抗PD-1抗体可以增强疫苗的功效[21]。这提示我们可以在接下来的研究中，评估胃癌干细胞DC疫苗是否具有更好的功效，同时，联合PD-1 抗体来增强疗效也将是不错的选择。除此以外，本研究并未探索GCSC疫苗的体内毒性，这会在今后的研究中进行系统的毒理学研究，以期更好的评估该疗法的临床应用的潜力。

总之，本研究检测了预防性GCSC疫苗在MFC小鼠模型中诱导的抗肿瘤免疫反应，结果表明，GCSC 疫苗可以激发小鼠的抗肿瘤免疫应答，增强NK细胞及细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒作用，提升机体细胞因子的分泌水平，抑制胃癌细胞的体内生长。这些结果支持对GCSC疫苗是否可以作为治疗性癌症疫苗的进一步评估，同时也表明其在胃癌治疗中的具有非常诱人的前景。