夏侯真如，薛孟祺，汪欣怡，张寅燕，杨 彤，文政琦，汪云松**，杨靖华**

(1. 云南大学 教育部自然资源药物化学重点实验室，云南省天然产物转化与应用重点实验室，化学科学与工程学院，云南 昆明 650091；2. 昆明医科大学 基础医学院，云南 昆明 650500；3. 昆明医科大学 第一附属医院，云南 昆明 650500)

炎症反应是机体必不可少的一种免疫应答方式，它能够在机体对抗外界刺激时起到有效保护作用，主要通过特异性或非特异性免疫的方式抵御病原体入侵并且对受损的组织细胞进行修复，而脂氧合酶（LOX）是其中的关键酶[1]. 脂氧合酶在人体中包含5-LOX、12/15-LOX 等亚型，它们能够促使炎细胞因子等介质表达，有利于抵御外界刺激，同时能够催化生成抗炎和促炎催化介质，有利于炎症反应的及时消退. 其中5-LOX 是重要炎症介质白细胞三烯的主要来源，是炎症反应研究中的重要靶点[2-4].目前已上市的齐留通（zileuton）等针对5-LOX 靶点的药物已展现出良好的临床效果，但其仍有肝毒性、半衰期短等缺陷，因此新型5-LOX 抑制剂的研究一直受到广泛关注[5-6].

樟科（Lauraceae）木姜子属（Litsea）植物作为一种传统药物资源[7]，经生物活性研究发现，其具有抗炎、抑菌、抗HIV 病毒等多种生物活性[8]. 其中木姜子属植物中的抗炎活性，已有广泛研究[9].例如，张义龙[10]对老鹰茶中正丁醇层化学成分抗炎免疫作用的研究，Choi Eun-Mi 等[11]验证了木姜子树皮甲醇提取物和组分对RAW264.7 细胞炎症介质产生影响. 本课题组在前期研究中通过分子对接虚拟筛选技术发现，木姜子属植物中的木脂素类化合物对5-LOX 靶点具有良好的抑制活性，并且魏江春等[12]在筒鞘蛇菰中发现的以及AlSayed Eman 等[13]在大果柏中发现的木脂素类分子均检测出了良好的抗炎活性，这表明木姜子属植物中的木脂素类化合物有着优良的抗炎药物开发潜力. 现代药物研究开发中计算机辅助技术有着举足轻重的地位，其中分子对接方法和药效团模型更是其中的经典可靠方法[14-16]. 因此，本文主要选用常用于5-LOX 抑制剂筛选的智人源（Homo sapiens）蛋白结晶3V99，对木姜子属植物中的木脂素类化合物进行分子对接筛选和药效团模型筛选，从而交叉对比分析筛选出其中优秀的木脂素类化合物，并初步阐释其活性残基结合和药效基团情况，为5-LOX抑制剂研究开发提供一定的参考.

1 材料与方法

1.1 平台与软件 本研究主要工作在Microsoft Windows 10 Professional 软件操作系统中进行，主要采用美国剑桥公司的ChemBioDraw 和ChemBio 3D（ChemOffice Professional 20）、Accelrys 公司的Discovery Studio 2016（DS）软件. 参数设置除特殊指明外均为默认值.

1.2 分子对接

1.2.1 受体数据库的组建 从 RCSB PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）搜索并下载常用于5-LOX抑制剂筛选的智人源的蛋白结晶3V99，其原配体名称为ACD_702. 这里选用的蛋白结晶3V99 是具有配体复合物的，并且其与稳定纯酶结晶（3O8Y）相似度较高，在活性空腔中心给抑制剂留有足够的空间，从而有助于提高筛选精度[17]. 将其导入Discovery Studio 2016（DS）软件，并进行蛋白质结构的准备以及分子对接受体蛋白的定义. 从系统视图中选中蛋白质分子3V99 并删除水分子，随后通过Macromolecules 工具栏中Prepare Protein 模块的Clean Protein 功能和Prepare Protein 功能，对蛋白质晶体结构的原子名称标准化并在残基中插入缺失的原子，同时去除交替构象，以及清除蛋白质晶体结构中的常见问题，为分子对接受体定义做准备. 选择Receptor-Ligand Interactions 工具栏中Define and Edit Binding Site 模 块 的Define Receptor 功 能，将处理后的蛋白质分子3V99 定义为受体分子，然后利用配体扩张法，选中系统视图中的蛋白质分子3V99 的Ligand Groups，使用相同模块下的From Current Seletion 功能，生成球体空腔即活性位点，并选中该球体空腔，设定其参数半径为1.2 nm，即在此范围内的残基为活性残基，最后保存备用.

1.2.2 配体数据库的组建 通过文献检索收集，已知目前从木姜子类植物中分离得到的木脂素类化合物共有35 个[9]（表1），通过ChemBioDraw 软件绘制其二维结构，并使用ChemBio 3D 模块转化为对应的三维结构，然后利用软件中的MMFF94 算法对其能量进行最低优化，设置最大迭代次数为5 000次，最大RMS 梯度为0.5，并分别保存为mol2 格式，将其作为分子对接的配体分子集备用.

表1 木姜子属植物中木脂素类化合物Tab. 1 Lignans compounds in Litsea plants

1.2.3 分子对接参数设置 本研究中主要采用Discovery Studio 2016（DS）软件中的CDOCKER 分子对接模块，CDOCKER 是一种在CHARMm 立场下产生高精度分子对接结果的技术，它是基于格点的分子对接方法，采用高温动力学产生配体的多种构象，且每个取向都采用模拟退火进行优化，使其具有较高的精准性. 将上述组建完成的受体蛋白和配体分别导入Dock Ligands 模块下的CDOCKER功能进行分子对接，设置靶点蛋白3V99 结合空腔坐标位置为：X：18.394 1，Y：-78.714 7，Z：-33.902 7，空腔半径为1.2 nm，Top Hits 参数中Pose Cluster Radius 为0.5，即将RMSD 阈值设为0.5，以确保对接构象具有多样性，其余参数保持不变.

1.2.4 结果处理 对接完成后，分别以靶点蛋白3V99 中原有配体以及阳性对照齐留通为参照，对接结果依据-CDOCKER ENERGE 进行评价，-CDOCKER ENERGE 数值越大则对接结果越好.为了保证评价结果的可靠性，取每个分子对接结果构象排名的前3 位，将其-CDOCKER ENERGE 数值的平均值作为最终得分. -CDOCKER ENERGE 的评价结果包含了内部配体应变能和受体-配体相互作用能，具有较高的可靠性. 因此，根据-CDOCKER ENERGE 结果，筛选出针对靶点蛋白3V99 得分排名靠前的化合物[18].

1.3 药效团模型

1.3.1 数据准备 通过UniProt 网站查找5-LOX蛋白代码，选取其中智人源蛋白代码P09917 备用.登录Binding Data Base 数据库，在Find Compounds for My Targets 搜索模块的复选框Add search criterion中选择Uniprotkb，并输入蛋白代码P00917. 通过数据库搜索获得关于5-LOX 蛋白活性的化合物，并将其保存为3D 文件备用.

1.3.2 训练集分子准备 在通过Binding Data Base 数据库获取的关于5-LOX 蛋白活性的化合物中，基于结构多样性原则，挑选活性不同的化合物，并且为了减小不同活性测试方法及测试机构的误差，本次研究中化合物的活性均以该化合物相应测试机构和方法下的齐留通活性数据为基准，即该相应机构及方法下的该化合物与齐留通的活性数据比值. 最终选取16 个结构不同、活性差距较大的化合物组成训练集[19-25]，其结构及活性比值见图1.

图1 训练集化合物及其活性比值Fig. 1 Training set compounds and their activity ratio

1.3.3 测试集分子准备 在通过Binding Data Base 数据库获取的关于5-LOX 蛋白活性的化合物中，随机选取24 个活性较好的化合物，再加入100个非活性分子，同时保证与训练集之间没有相同化合物存在，以此组成共124 个化合物的测试集，验证药效团模型的可靠性.

1.3.4 5-LOX 抑制剂药效团模型的构建 本次药效团模型建立主要采用Discovery Studio 2016（DS）软件中的Pharmacophores 工具. 首先，为训练集所有化合物添加定义Principal 值和MaxOmitFeat 值，其中Principal 值定义了小分子的活性水平，2 代表有活性， 1 代表中等活性， 0 代表无活性；MaxOmitFeat 值定义了每个分子中允许不与药效团模型匹配的特征元素个数，0 代表必须全部匹配，1 代表允许1 个不匹配，2 代表无需匹配. Principal值越大，MaxOmitFeat 值越小，表明分子结构对药效团贡献越大. 因此对于本次训练集中的16 个分子进行如表2 中的定义. 其次，使用Edit and Cluster Features 模块中的Feature Mapping 功能对训练集分子进行药效团特征元素的提取，特征元素类型选择HB_ACCEPTOR（氢键受体）、HB_DONOR（氢键供体）、HYDROPHOBIC（疏水基团）、POS_IONIZABLE（正电中心）和RING_AROMATIC（芳香环中心）共5 种特征元素. 最后，通过Create Pharmacophores Automatically 模块下的Common Feature Pharmacophore Generation 功能完成基于分子共同特征的药效团模型构建[19]. 其中药效团特征元素选择不变，Conformation Generation 中选择BEST 分析方法，能量阈值Energy Threshold 设置为20.0，最大排除体积 maximum excluded volumes设置为3，药效团最大生成数量Maximum Pharmacophores 设置为10[26].

表2 训练集Principal 值和MaxOmitFeat 值定义Tab. 2 Setting of Principal value and MaxOmitFeat value of training set

1.3.5 药效团模型测试集匹配验证 选择并使用Pharmacophores 工具栏下Search，Screen and Profile 模块的Ligand Profiler 功能，利用准备好的测试集分子与生成的10 个药效团模型进行匹配验证，多次调整参数，选取匹配结果最好的药效团模型作为最优药效团模型. 药效团模型评价主要依据CAI 体系，其中CAI 值越大则在一定程度上说明药效团模型越可靠. CAI 体系主要依据A，Y，N和CAI 四个参数，其计算公式如下：

其中，D为训练集化合物总数，Ai为训练集中活性化合物个数；Ht为药效团模型命中的总化合物数，Ha为药效团模型命中的活性化合物个数；A表示活性成分命中率，Y表示有效命中率，N表示有效辨识指数，CAI 表示综合评价指数. 本次研究中以CAI 最高的药效团模型作为最优药效团模型[27-29].

1.3.6 最优药效团数据库筛选 通过Build Databases模块的Build 3D Database 功能，将木姜子属植物中的35 种木脂素分子构建成小分子数据库，作为筛选备用. 通过Search，Screen and Profile 模块的Search 3D Database 功能，利用上一步得到的最优药效团模型，对构建的小分子数据库进行匹配筛选. 最终筛选结果以FitValue 值评价，其值越高，则代表小分子与药效团模型匹配得越好.

2 结果

2.1 分子对接 木姜子属中木脂素类化合物针对于靶点蛋白3V99 的筛选结果如表3 所示. 通过对比35 种木脂素分子的筛选结果，可发现化合物32号和33 号的打分结果均优于原配体ACD_702 和上市药物齐留通. 展示化合物32 号和33 号分别与蛋白结晶3V99 的2D 相互作用图（图2）及主要残基作用情况表（表4），并与ACD_702 和齐留通的进行对比，可发现化合物32 号与33 号相较于ACD_702 和齐留通的残基相互作用模式较为接近.

表3 对接得分结果Tab. 3 Docking score result

表4 主要残基作用情况表＊Tab. 4 Action table of main residues

图2 32 号、33 号、ACD_702、齐留通分别与受体蛋白3V99 相互作用2D 图Fig. 2 3V99 2D interactions with nos. 32, 33, ACD_702 and zileuton, respectively

2.2 药效团模型

2.2.1 药效团模型评价 在本文5-LOX 抑制剂的药效团研究中，使用构建的训练集分子共生成了10 个药效团模型，其药效特征和Rank 值见表5.其中，药效团模型01 具有最高的打分值，表明该药效团与训练集化合物具有更高的匹配性. 进一步通过测试集和CAI 体系进行评价，评价结果如表6所示. 其中，药效团模型10 具有最大的CAI 值，其活性成分命中率A、有效命中率Y、有效辨识指数N，均有较高的表现，表明其具有较强的筛选预测能力，因此，确定药效团模型10 为最优药效团.

表5 药效团模型构建结果Tab. 5 Results of pharmacophore model construction

2.2.2 药效团模型筛选 根据获得的最优药效团对木姜子属植物中的35 个木脂素类化合物进行虚拟筛选，筛选结果如表7 所示，共有34 个分子能够与药效团进行匹配，这表明木姜子属植物中的木脂素类化合物与5-LOX 抑制剂药效团模型有较高的整体匹配性. 每个分子的匹配性依据Fit Value值进行评价，其值越高表明分子与药效团模型匹配程度越高. 从表7 中可以看出，化合物33、32 具有较高的匹配性，两者与药效团模型10 匹配见图3.

图3 33、32 号化合物与药效团模型10 的匹配图Fig. 3 Matching diagrams of No.33 and No.32 compounds with pharmacophore model 10 respectively

表7 木脂素类的药效团模型筛选结果Tab. 7 Screening results of pharmacophore model of lignans

3 分析与结论

3.1 分子对接 根据5-LOX 抑制剂筛选常用的智人源蛋白质晶体3V99 的分子对接筛选结果，木姜子属植物中木脂素类化合物32 号和33 号的-CDOCKER ENERGE 打分数值均高于原配体ACD_702 和上市药物齐留通. 通过2D 相互作用图的对比，在与受体蛋白3V99 的相互作用关系中，化合物32 号与受体蛋白3V99 中的活性残基ALA672 可以形成静电相互作用Pi-Anion，与活性残基HIS372、HIS367 形成较弱的氢键Carbon Hydrogen Bond；化合物33 号则与ALA672、HIS367有相同的相互作用关系，但与HIS372 相互作用较弱，这与齐留通的结合模式类似，且32 号和33 号都与HIS372、HIS367 具有相互作用关系，这与原配体ACD_702 结合作用类似. 综合上述分析结论，木姜子属植物中木脂素化合物32 号和33 号具有与齐留通和原配体ACD_702 相似的活性残基作用模式，并且与文献报道的部分相关活性残基相似[18]，因此其活性作用表现可能具有相似性. 除此之外，32 号和33 号共有的与ILE406、LYS409、ALA603、PHE610 形成的疏水作用有利于和受体蛋白3V99 的结合，GLN363、FE2701 等残基的结合也对配体与受体的复合产生了有利作用，从而提高了分子对接评价，因此与这些残基的结合或可提高5-LOX 抑制剂的潜力.

3.2 药效团模型 根据测试集测试和CAI 体系评价获得的5-LOX 抑制剂最优药效团模型的筛选结果，与木姜子属植物中34 种木脂素类化合物具有较优的整体匹配性，这一定程度上说明木姜子属植物中的木脂素类分子具有一定的5-LOX 抑制剂潜力.其中化合物33、32 具有较高的匹配性，且与分子对接结果相吻合，这表明这两种化合物具有较高的5-LOX 抑制剂潜力. 同时，根据最优药效团模型的药效特征，具有两个芳香环中心、一个疏水基团、一个氢键受体的类似化合物具有5-LOX 抑制剂的研究可能性.

3.3 结论 现代药物研究开发越来越离不开计算机辅助技术，分子对接方法和药效团模型分别作为计算机辅助药物设计中针对受体和针对配体的经典方法具有相辅相成的作用. 本文通过综合分子对接和药效团模型的虚拟筛选技术研究，推测木姜子属植物中的木脂素类化合物具有5-LOX 抑制剂的开发潜力，特别是其中的32 号和33 号化合物具有较高的潜在价值，值得对其真实药理药效作用及活性情况做进一步研究，这为5-LOX 抑制剂的开发研究提供了一定的方向.