张 花，顾丽莉**，李增良，唐徐禹，彭 健，黄智华，李江舟，张立猛

(1. 昆明理工大学 化学工程学院，云南昆明 650500；2. 云南省烟草公司 玉溪市公司，云南玉溪 653100)

烟草，茄科烟草属植物，一年生或有限多年生草本植物，叶矩圆状披针形，顶端渐尖，原产于南美洲，中国南北各省区广为栽培. 云南约有40%的土地面积属于烤烟种植最适宜区，是中国规模最大的“两烟”生产基地，其烟叶生产量约占全国总产量的1/3[1]，对中国农产品财政收入贡献较大[2]. 多酚类物质是烟叶中一种重要的次生代谢产物，也是烟气香味的重要前体物质之一. 烟叶中的多酚主要包括黄酮类 (芦丁) 、单宁类 (绿原酸) 以及香豆素类物质 (莨菪灵、莨菪亭、七叶亭) 等，其中绿原酸、芸香苷 (芦丁) 和莨菪亭是烟叶中最主要的多酚，且绿原酸可占多酚总量的75%～95%[3]. 多酚类物质的种类及含量对烟叶色泽、卷烟香气、卷烟吸味有着重要影响，是评估烟草制品品质的重要指标[4-5].所以，有效提取分离并研究烟叶中的多酚类物质，将其应用到食品、医药保健[6-8]等领域，不仅能提高烟草相关产品的品质，而且能增加烟草制品的经济利用价值.

一直以来，烟油的分离是烟叶有效成分提取的重要方向，超临界萃取方法的零溶剂残留优势使其应用越来越广泛，对烟叶烟油的提取也不例外[9]，但人们却忽视了经过超临界萃取之后烟叶的再利用价值. 实际上，超临界萃取后的烟叶中仍含有大量活性物质（如多酚和黄酮类化合等），值得进一步加以利用. 本研究按照图1 路线分别探究了超声提取法、超临界萃取法以及超临界-超声辅助提取法所得烟油、多酚和其他主要成分的差异，结果表明，超临界-超声辅助提取法所得烟油及多酚的得率优于超声提取法和超临界萃取法.

图1 实验路线Fig. 1 The experimental route

1 实验部分

1.1 样品、试剂与仪器 样品：云南省元江C3F 初烤烟叶，品种K326.

试剂：无水乙醇、乙酸乙酯，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司；丙酮，分析纯，成都市科龙化工试剂厂；没食子酸标品（纯度ω=99%）、福林酚试剂，上海麦克林生化科技有限公司；无水碳酸钠，分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；无水甲醇，分析纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；绿原酸标品（纯度ω=95%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芸香苷（芦丁），纯度ω=98%，北京百灵威科技有限公司；莨菪亭（东莨菪内酯）、咖啡酸、槲皮素、山奈酚，纯度ω≥98%，北京索莱宝科技有限公司；娃哈哈饮用纯净水，衡阳娃哈哈恒枫饮料有限公司.

主要仪器：SFE-500 型超临界CO2萃取仪，Thar 科技公司；RE-2000A 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；KQ-250DE 型数控超声波仪，昆山市超声仪器有限公司；Agilent 1290/6460 型液相色谱串联质谱仪（LC-MS/MS），德国安捷伦科技有限公司；7890A-5975C 型气质联用设备（GC-MS），德国安捷伦科技有限公司；BSA224S 型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；RHP-600 型高速多功能粉碎机，浙江荣浩工贸有限公司；UV-2550 型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；蔡司Gemini300 扫描电镜，德国蔡司公司.

1.2 实验方法

1.2.1 超声辅助提取 通过查阅相关文献[10]及初步实验探究，分别选用甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯、丙酮以及醇类的水溶液作为萃取植物中多酚类物质的溶剂，并通过对比不同溶剂的提取效果选出最佳溶剂. 根据课题组前期研究并结合相关文献[11-12]，按照表1 设计四因素三水平的正交实验，探究超声提取初烤烟叶中烟油及多酚的最佳工艺条件.

表1 超声辅助提取正交实验方案Tab. 1 Orthogonal experimental scheme for ultrasoundassisted extraction

1.2.2 超临界CO2流体萃取（SFE） 采用本课题组前期研究结果[13]，从初烤烟叶超临界萃取烟油的最佳条件为：萃取压力25 MPa、萃取温度50 ℃、CO2流量20 g/min 和萃取时间120 min.

1.2.3 超临界-超声辅助提取 以经过超临界萃取（条件同1.2.2 节）之后的烟叶为原料，采用1.2.1中所选最佳溶剂和表1 的正交实验方案，探究超声辅助提取上述原料中烟油及多酚的最佳工艺条件.

1.2.4 烟油及多酚提取率的计算方法式中：m1为烟油质量，g；m2为烟油中总多酚的质量，由公式（2）得到，g；mi为烟油中某种多酚i的质量，g；m总为烟叶原料质量，g；ρ为通过液质检测得到多酚的质量浓度，g/mL；V为样品液定容体积，mL；n为提取液的稀释倍数.

1.3 多酚的测定

1.3.1 总多酚含量的测定 采用福林酚比色法[14-16]测定烟叶中的总多酚含量，配制没食子酸标准溶液，用紫外分光光度计于760 nm 波长处测其吸光度值. 没食子酸质量浓度x(公式（2）中的ρ)为横坐标，吸光度值y为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，得到标准曲线方程（6），其相关系数为R2=0.996 7.

1.3.2 每种多酚化合物的定性定量检测[17]采用高效液相色谱-质谱检测提取烟油中的各种多酚含量. 高效液相色谱条件：色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（ φ4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱温为30 ℃；流速为0.2 mL/min；进样量为1 μL；流动相A 为0.1 %甲酸水溶液，流动相B 为甲醇，按表2 条件梯度洗脱. 质谱条件：电喷雾离子（ESI）源，正离子模式；毛细管电压4 000 V；干燥气流速10.0 L/min，干燥气温度300 ℃；雾化器压力413.69 kPa；采集模式为多反应离子监测（MRM）采集. 通过公式（4）计算mi.

表2 流动相梯度洗脱程序Tab. 2 Mobile phase gradient elution procedure

1.3.3 烟油成分的测定 采用气相色谱联用质谱（GC-MS）检测所得烟油成分. 气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS (30 m× φ0.25 mm，0.25 μm)；进样温度250 ℃；程序升温：柱温 80 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持3 min，最后以8 ℃/min 升至280 ℃，保持10 min；He 载气，流量1.0 mL/min；分流进样，分流比为50∶1，进样体积0.2 μL. 质谱条件：EI 离子源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃；电离能70 eV，全离子扫描检测质量数范围50～550 ，溶剂延迟3 min.

2 结果与分析

2.1 超声辅助提取烟油及多酚 分别以甲醇、乙醇、水、乙酸乙酯、丙酮以及50 %乙醇为溶剂，超声提取烟叶中的烟油及多酚，不同溶剂的提取效果如图2、3 所示. 其中，图2 以烟油得率为纵坐标，图3 以烟油中6 种多酚（绿原酸、芸香苷（芦丁）、咖啡酸、槲皮素、莨菪亭、山奈酚）的得率为纵坐标. 从图2、3 中可以看出，以50%乙醇作溶剂时提取效果最好. 醇类水溶液对多酚物质的提取效果较好，后期可通过改变醇的体积分数调整溶剂的极性寻找更优溶剂；另外，乙醇的沸点低，在旋蒸时利于除去，可减少溶剂残留，并且乙醇溶液相对于其他有机溶剂对人体更加安全，符合烟草吸食制品的安全性要求，故后续实验中优选不同体积分数的乙醇水溶液作溶剂.

图2 不同溶剂所提取烟油含量的差异Fig. 2 Difference of contents of tobacco oil extracted by different solvents

图3 不同溶剂所提取多酚含量的差异Fig. 3 Difference of contents of polyphenols extracted by different solvents

通过正交实验优化（见表3）所得超声提取烟叶中烟油及多酚的最佳条件为：以60%乙醇为溶剂，超声温度60℃，超声功率200 W，超声时间40 min.该条件下以元江K326/C3F 初烤烟叶为原料进行验证性实验，所得烟油得率为61.07%；6 种多酚提取率为1.74%；总多酚提取率为3.22%. 所得烟油经GC-MS 检测，其中含量较高的主要为烟碱、新植二烯、戊酸、1，5，9-三甲基-12-（1-甲基乙基）-4，8，13-环四十三碳三烯-1，3-二醇.

表3 超声辅助提取初烤烟叶多酚的正交实验结果Tab. 3 Orthogonal experiment results on ultrasonic-assisted extraction of polyphenols from primary flue-cured tobacco leaves

2.2 超临界CO2流体萃取烟油及多酚 根据本课题组前期研究，超临界萃取初烤烟叶中烟油得率最高可达3.20%，GC-MS 检测其主要成分为烟碱、新植二烯、（Z，Z，Z）-9，12，15-十八碳三烯酸、维生素E、正十六烷酸等[13]. 紫外分光光度计检测并计算烟油中总多酚提取率仅为0.000 2%，表明超临界萃取烟油中多酚含量极少. 文献报道[18]表明，不同来源烟草多酚类物质的含量变化范围较宽，一般占烟叶质量的0.52%～6.04%；不同基因型烤烟中多酚的平均质量分数一般为3.21%[19]，说明多酚化合物仍保留于超临界萃取后的烟叶中，故对经过超临界萃取之后烟叶中的烟油和多酚进行超声辅助提取.

2.3 超临界−超声辅助提取烟叶中的烟油和多酚以经过超临界萃取（条件同1.2.2 节）之后的烟叶废料为原料，通过正交实验优化（表4）得到超声辅助提取烟油及多酚的最佳条件为：以60%乙醇为溶剂，超声温度50 ℃，超声功率200 W，超声时间30 min. 验证实验表明，该条件下烟油的平均得率可达67.5%，6 种多酚提取率可达2.51%，总多酚提取率可达3.15%. GC-MS 检测烟油的主要组分为烟碱、氟乙酸甲酯、双（乙烯砜甲基）醚、环丙烷-二甲酰、2，4-二-叔丁基苯酚、n-丙氧羰基-乙酯、D-脯氨酸，n-甲氧羰基-戊酯、5，6-癸烷酯、3，4-二甲基-1，2，5-噁二唑、邻苯二甲酯、二氟胺和6-氮杂尿嘧啶.结果证明，超临界萃取所得烟油和超声提取初烤烟叶中烟油的成分主要为烃类及烃的衍生物；超临界-超声辅助提取所得烟油中多酚和杂环化合物种类较多，说明超临界萃取过程对下一步超声提取烟叶中的更多活性物质创造了条件.

表4 超声辅助提取烟叶废料中的多酚正交实验Tab. 4 Orthogonal experiment of ultrasonic-assisted extraction of polyphenols from tobacco waste

按照表1 的正交实验方案，分别比较超声辅助提取、超临界-超声辅助提取两种方法在9 组条件下所得烟油及多酚的差异，实验结果如图4、5 所示. 超临界-超声辅助提取烟油及多酚的得率均高于超声辅助提取，表明超临界萃取过程具有强化作用，该作用有益于后期的超声辅助提取，为此，对超临界萃取前后的初烤烟叶0.28 mm(60 目)粉末和1 cm2碎片进行了形貌表征.

图4 超声提取与超临界−超声辅助提取所得烟油含量差异Fig. 4 Differences in the contents of tobacco oil extracted from ultrasonic extraction and supercritical ultrasonicassisted extraction

图5 超声提取与超临界−超声辅助提取所得多酚含量差异Fig. 5 Differences in the contents of polyphenols extracted from ultrasonic extraction and supercritical ultrasonicassisted extraction

图6 和图7 分别为超临界前后0.28 mm(60 目)烟末和1 cm2烟叶碎片的扫描电镜形貌图，比较图6（a）与图6（b），图7（a）与图7（b）可见，初烤烟叶原料经过超临界CO2流体的作用，恢复常压后，烟叶表面组织被破坏，致使烟叶深层的纤维组织得以暴露，打开了多酚物质及其他组分溶出的更多通道，使溶剂分子与烟叶组分的接触面大大提高，促使多酚物质和其他组分更容易被溶出. 故而在随后的超声提取中，从烟叶中可更多地提取得到烟油和多酚化合物，验证了超临界萃取不仅可作为一种提取分离技术，也可作为一种有效的前期辅助手段，为下一步提取创造条件，能更好地提高烟叶原料的利用率，增加其附加值. 几种提取工艺的结果汇总于表5 中.

图6 烟叶粉末的外观形貌（×2 500）Fig. 6 The appearance morphology of tobacco powder

图7 烟叶碎片的外观形貌（×250）Fig. 7 The appearance morphology of tobacco leaf fragments

表5 最佳条件下3 种提取路线的结果汇总Tab. 5 Summarization of the results of three extraction routes under optimal conditions

3 结论

本实验分别探究了超声提取法、超临界萃取法以及超临界-超声辅助提取法从烟叶中提取烟油得率和多酚以及其他主要成分的差异. 结果表明，超临界-超声辅助提取法所得烟油及多酚的得率优于超声提取法和超临界萃取法，证明前期超临界萃取过程使烟叶深层纤维组织得以裸露，能打开多酚物质及其他组分溶出的更多通道，为后期烟油及多酚的高效提取创造良好条件. 同时，本研究中超临界-超声辅助提取烟叶中的烟油和多酚工艺可得到以烟碱含量为主的零溶剂烟油，能为进一步分离纯化烟碱提供原料储备，极好地提高了烟叶原料的利用率及其附加值，并且该方法操作成本较低，易于工业化生产.