房锐颖 张亚萍 陶云珍 黄莉莉

肠杆菌目细菌(carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE)是引起感染最常见的革兰阴性细菌，而碳青霉烯类抗生素是目前治疗革兰阴性杆菌感染的最有效的抗生素之一。但随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，对碳青霉烯类抗生素耐药的CRE检出率呈逐年上升趋势，严重加大了临床抗感染治疗难度[1]。全国耐药监测网数据[2]显示，2019年我国部分地区碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CR-KPN)检出率已超过30%，这需要相关部门高度重视CRE的防控及治疗。碳青霉烯酶的产生是CRE对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因，而blaNDM、blaKPC、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48是CRE中检出率最多的碳青霉烯酶。不同地区、不同人群CRE的分离情况、耐药性及主要耐药机制均可有差异，为了解本地区儿童CRE的临床分离及耐药情况，本研究分析了2018～2020年苏州大学附属儿童医院CRE的临床分离情况、耐药特点及 5类碳青霉烯酶的检出情况，以期对本地区儿童CRE的临床治疗及传播防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2018～2020年，苏州大学附属儿童医院微生物室共分离到的1 898株肠杆菌科细菌。其中182株为CRE(删除同一患儿分离的重复菌株)。

1.2 细菌鉴定与药敏 所有细菌分离培养均按照《全国临床检验操作规程》[3]进行，获得目的菌后，采用布鲁克细菌鉴定质谱仪(MALDI Biotyper，德国布鲁克公司 )进行鉴定。药敏采用仪器法(VITEK 2 Compact，法国梅里埃公司)测量最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)及纸片琼脂扩散法进行，药敏结果判断标准采用美国临床实验室标准化委员会2020年判断标准[4]。药敏试验所采用的培养基为MH(Mueller-Hinton)琼脂平板(安图生物有限公司)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.3 耐药基因检测 煮沸法提取细菌DNA模板，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)引物参照文献[5]设计，引物由金斯瑞生物科技公司合成。引物序列及产物大小如表1所示。按照PCR试剂盒(2×EasyTaq© PCR SuperMix，北京全式金生物有限公司)说明书要求，反应体系为：上下游引物各10 μmol/L，模板1 μL，PCR试剂10 μL，其余用灭菌蒸馏水补至20 μL。PCR反应使用ProFlex 梯度PCR仪(美国ABI公司)进行，扩增参数：94℃ 预变性4 min，94℃ 变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸50 s，共35个循环，最后72℃ 延伸10 min。PCR产物5 μL点样于1.5%的琼脂糖凝胶中，100 V电泳45 min，然后在紫外凝胶成像系统中观察结果。将blaNDM阳性PCR产物及随机抽取的其他基因PCR产物一份送金唯智生物科技有限公司测序，测序结果在NCBI中进行BLAST比对后，作为阳性对照。

表1 碳青霉烯酶基因引物及产物大小

2 结果

2.1 CRE的分离情况

2.1.1 2018～2020年菌种的检出情况 2018～2020年，苏州大学附属儿童医院共分离得到1 898株肠杆菌科细菌，其中182株(9.59%)为CRE，以大肠埃希菌[100株(54.95%)]和肺炎克雷伯菌[71株(39.01%)]为主。见表2。

表2 2018～2020年苏州大学附属儿童医院CRE检出情况

2.1.2 科室分布情况 CRE的科室分布以新生儿科为主[72株(13.58%)]，但肾内科CRE分离率最高[26株(23.42%)]。见表3。

表3 不同科室中CRE检出情况

2.1.3 标本分布情况 CRE在尿液中分离数量最多[96株(17.05%)]，但分离率最高的标本为咽拭子[4株(40%)]。见表4。

表4 不同标本的CRE分离情况

2.2 患儿情况 1 898株肠杆菌目细菌分离于1 812名患儿，以住院患儿为主[1 671名(92.22%)]，患儿男女比例为1.16∶1。182株CRE分离于179名患儿，其中，住院患儿173名(96.65%)。携带CRE的男性患儿为75名(41.90%)，女性患儿104名(58.10%)，患儿男女比例为0.72∶1。女性比男性更易分离出CRE(P=0.003)。患儿以低龄儿童为主，特别是新生儿，随着年龄增大，CRE的分离率随之下降。见表5。

表5 携带CRE的患儿年龄分布情况

2.3 CRE药物敏感情况 CR-ECO对氨基糖苷类的庆大霉素耐药率(25%)最低，其余抗生素耐药率均高于80%。CR-KPN对氨基糖苷类的庆大霉素(21.13%)、妥布霉素(23.94%)以及喹诺酮类的左氧氟沙星(33.80%)耐药率较低外，其余各类抗生素耐药率均大于50%。见表6。

表6 CR-ECO及CR-KPN的药物耐药情况

2.4 耐药基因检测情况 在182株CRE中，随机挑选127株检测其blaNDM、blaKPC、blaIMP、blaVIM及blaOXA‐48基因，包括肺炎克雷伯菌61株，大肠埃希菌62株，阴沟肠杆菌2株，产酸克雷伯菌1株，产气肠杆菌1株。共有74株(58.27%)CRE检测出上述5类碳青霉烯酶基因。其中，肺炎克雷伯菌菌检出47株(63.51%)，大肠埃希菌检出25株(33.78%)，阴沟肠杆菌检出1株(1.35%)，产酸克雷伯菌检出为1株(1.35%)。其中19株(40.43%)肺炎克雷伯菌，4株(16.00%)大肠埃希菌同时表达2种碳青霉烯酶基因，8株(17.02%)肺炎克雷伯菌同时表达3种碳青霉烯酶基因。共有42株CRE检出了blaNDM基因，其中，15株产NDM-2酶，25株产NDM-5酶，2株产NDM-9酶。见表7。

表7 肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌中5种碳青霉烯酶的检出情况(株)

3 讨论

细菌耐药株的分布受多种因素影响，如地区、人群、卫生条件、抗生素使用情况等，及时监测耐药菌的流行特征有利于控制耐药菌的播散。目前有关儿童CRE流行病学数据较少。本研究分析了2018～2020年苏州大学附属儿童医院CRE的流行特征及耐药特征，以期对苏州地区儿童CRE的预防及治疗提供依据。

2018～2020年，苏州大学附属儿童医院CRE以CR-ECO(100株)为主，CR-KPN(71株)次之，平均检出率为9.59%。略高于2018年全国儿童平均检出率(8.7%)[6]，而成人以CR-KPN 为主，CR-ECO次之[7-8]。近3年，苏州大学附属儿童医院CR-ECO分离率分别为7.96%、6.76%和14.24%，均高于全国耐药监测网公布的江苏省CR-ECO分离率(2018年2.7%，2019年2.6%)。提示CR-ECO是本地区儿童感染的优势菌，且耐药形势严峻，需要高度重视。

在苏州大学附属儿童医院，CRE分离部位前3位为尿路感染(96株)、呼吸道感染(58株)和血液感染(16株)。与日本地区研究[9]结果类似，但与郑州地区及成都地区儿童CRE(主要来源于呼吸道标本)分离情况不同[10]。分离CRE最多的科室依次为新生儿科(39.56%)、肾内科(14.29%)、ICU(13.19%)和血液科(13.19%)。与全国耐药监测网(http://www.carss.cn/Report)中公布的近年全国平均数据及王冰洁等[11]研究数据相吻合。可能是因为新生儿生理发育尚未完善、免疫力较弱，且适合使用的抗生素剂量、种类较为局限等因素导致了新生儿科CRE分离数量较多。此外，住院时间较长、插管等因素也会增加CRE在院内播散。

本研究中，58.27%的CRE检出了5种常见碳青霉烯酶，以NDM型为主，KPC型次之。其中，blaNDM以NDM-5型为主，NDM-2型次之。而成人CRE以blaKPC为主，blaNDM次之[2]。与苏州邻近的上海地区blaNDM以NDM-1为主，NDM-5次之[12]。提示不同人群、不同地区的CRE分离情况有差异。近年来，全球各地陆续有CRE共表达多个碳青霉烯酶的报道[13]。本研究中也发现多株CRE同时表达多种碳青霉烯酶基因。特别是表达blaVIM，以及表达blaNDM的CR-KPN更倾向于共表达其他碳青霉烯酶。与blaVIM共表达最多的是blaNDM(13株，56.52%)，其次为blaOXA-48(11株，47.83%)。与blaNDM共表达最多的是blaVIM(13株，81.25%)，其次为blaOXA-48(7株，43.75%)。Bush等[13]发现，成人CRE中与blaVIM共表达最多的是blaKPC，与blaNDM共表达最多的是blaOXA-48。不同型别的碳青霉烯酶对抗生素的水解作用不同[14]，而同时产生多种类型的碳青霉烯酶，易导致单一药物治疗无效，需要联合治疗或者研发新的复合型抗生素，增加了治疗的难度。

综上所述，苏州大学附属儿童医院CRE分离率较高。主要表达的碳青霉烯酶谱与成人及其他地区儿童存在差异，且存在多株CRE同时表达不同种碳青霉烯酶。因此，应加强对本地区患儿CRE携带情况的监测，规范儿童抗生素使用，持续重视并采取有效措施来预防及控制耐药基因在院内的水平传播。