白静科 何雷 吴彦辉 陈玉国 杨晋燕 牛龙龙 李成军 李淑君

摘  要：为进一步明确河南烟区主要病毒种类及侵染类型，2020年从河南9个烟区分别采集疑似烟草普通花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）和烟草蚀纹病毒（TEV）侵染的烟草样本共407份，分別利用上述4种病毒的特异性引物进行单重RT-PCR病原检测。检测结果表明，河南烟区病毒病样本的总检出率为98.28%，其中，检出率最高的是CMV为89.19%，其余依次为TMV 63.88%、PVY 28.99%和TEV 24.32%。侵染类型分为单一病毒侵染和复合病毒侵染，单一病毒侵染率为23.34%，该侵染类型中CMV所占比例最高，为16.71%;复合病毒侵染率为74.94%，复合病毒侵染类型中CMV+TMV所占比例最高，为36.86%，其次分别为CMV+TMV+PVY和CMV+TEV+PVY两种侵染类型，侵染比例均是7.62%。因此，CMV是2020年河南烟区的优势病毒，田间侵染以复合病毒侵染为主，侵染类型主要有CMV+TMV、CMV+TMV+PVY及CMV+TEV+PVY。

关键词：河南烟区;病毒病;侵染类型

Abstract： To further clarify the main virus species and infection type in Henan Province， 407 samples were collected from nine tobacco-growing areas in Henan Province in 2020. The samples were suspicious of being infected by Tobacco mosaic virus （TMV）， Cucumber mosaic virus （CMV）， Potato virus Y （PVY） and Tobacco etch virus （TEV） respectively. Then four pairs of specific primers were used to detect viruses that infected tobacco samples by single RT-PCR. The results showed that the infection percentage of virus diseases in Henan tobacco-planting areas was 98.28%， in which CMV （89.19%） took the top spot followed by TMV （63.88%）， PVY （28.99%） and TEV （24.32%）. It also suggested that infection type included single infection and co-infection. What's more， single infection rate was 23.34%， in which CMV had the highest infection percentage with 16.71%. And co-infection percentage was 74.94% which was much higher than the single infection rate. Furthermore， there were three main co-infection types， including CMV+TMV with the highest infection percentage 36.86%， followed by CMV+TMV+PVY and CMV+TEV+PVY which both had an infection percentage of 7.62%. Therefore， CMV was the dominant virus in Henan Province in 2020. And the infection types were CMV+TMV， CMV+TMV+PVY and CMV+TEV+PVY， which indicated that co-infection types occurred seriously in tobacco field.

Keywords： Henan tobacco-growing area; virus disease; infection type

烟草是我国的重要经济作物，烟草病毒病是危害烟草生长的主要病害，其造成的产量损失可达30%～50%，严重时甚至造成绝产。目前在中国烟草上报道的病毒超过25种，较常见的有烟草普通花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、烟草蚀纹病毒（TEV）和烟草脉带花叶病毒（TVBMV）等[1-3]。长期以来，RT-PCR技术凭借其高灵敏度特点被广泛应用于病毒检测中，孔宝华等[4]、杨金广等[5]、郑轩等[6]、张俊祺等[7]、杨洋等[8]分别建立了几种主要病毒的单重RT-PCR和多重RT-PCR检测方法，为准确快速检测烟草病毒病提供了技术保障。截止到目前，烟草病毒研究学者基于RT-PCR技术分别明确了广西[5]、陕西[6]、云南[2，9]、湖南[10]、毕节[11]等地烟草病毒病的种类、分布及侵染情况。

河南烟区作为我国浓香型烤烟风格的重要产区，学者们对其烟草病毒病的关注度也较高，李淑君等[12]鉴定发现2000年许昌烟区病毒病主要有PVY、CMV、马铃薯X病毒（PVX）、TMV、烟草环斑病毒（TRSV）等;李义强等[13]报道河南地区2000—2002年主要病毒种类是PVY和CMV;青玲等[1]在2005—2008年间仅发现PVY单独侵染河南烟草;罗朝鹏等[14]发现2010年侵染河南烟草的病毒以CMV和TMV为主;张全民等[15]调查发现2012年TMV、CMV是平顶山烟区的主要病毒，PVY、TEV在河南各地普遍发现并日趋严重;白静科等[3]检测发现2015—2017年河南烟区危害最为严重的病毒依次为TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV。

就同一烟区而言，不同年份引起烟草病毒病流行的优势毒原会发生变化[1]，目前对河南烟区病毒种类的研究也局限于ELISA方法，鉴于此，本研究选取前人研究发生较多的TMV、CMV、TEV和PVY 4种病毒，于2020年在河南煙区分别采集疑似该4种病毒侵染的样本，利用单重RT-PCR技术对这4种病毒分别进行病原检测，以期进一步明确近年来河南烟草主要病毒的发生种类及侵染类型，为病毒病的精准有效防治提供数据支持。

1  材料与方法

1.1  试验材料

于2020年5—8月在河南省9个烟叶产区采集疑似TMV、CMV、TEV、PVY症状的样本共407份，其中三门峡76份、洛阳60份、济源10份、许昌80份、平顶山52份、漯河25份、驻马店30份、南阳62份、信阳12份。样本症状主要表现有植株矮化，叶片花叶、畸形、闪电纹，蚀刻斑，脉坏死等。所采集样本为单株样本，采集部位为植株上部幼嫩叶片，采集样本放入纸袋中，液氮速冻后于−80 ℃保存备用。

1.2  试验方法

1.2.1  总RNA提取  采用Trizol法提取植物总RNA，取0.1 g烟叶样本，使用Trizol（Thermo Fisher Scientific 公司）试剂提取总RNA，具体方法参照试剂说明书，以健康烟草叶片为阴性对照。用Eppendorf D30紫外分光光度计测定所得RNA的浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

1.2.2  cDNA第一链的合成反应  按照反转录试剂盒[PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect real-time），TaKaRa公司]说明书，去除基因组DNA后，RT-PCR合成cDNA，−20 ℃保存用于后续试验。

1.2.3  PCR扩增和目的片段克隆  用于TMV、CMV、TEV、PVY扩增的特异性引物参考文献[6]，具体见表1。PCR反应体系：cDNA产物2 µL，10 µmol/L上下游引物各0.5 µL，2×Taq PCR MasterMix II（天根生化科技有限公司）10 µL，用ddH₂O补足至20 µL。反应条件为：94 ℃变性5 min，然后是94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环，最后在72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，于紫外灯下观察电泳结果并照相记录。

1.2.4  PCR产物回收、测序与序列分析  将上述PCR产物分别在紫外透射仪上切下相应条带，参照胶回收试剂盒（TaKaRa Mini BEST Agarose GEL DNA Extraction Kit，TaKaRa公司）说明书进行纯化回收，回收后的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列测定。测定序列在GenBank数据库中进行Blast比较分析。

2  结  果

2.1  烟草总RNA提取质量检测

用Trizol法提取烟草样本总RNA，经1%琼脂糖凝胶电泳后可见28 S和18 S两条清晰的条带，无DNA条带，结果如图1所示。提取样本的OD260/OD280比值均在1.7～1.9，表明样本组织中蛋白质和酚类物质基本去除。提取的RNA纯度较理想，可用于后续研究。

2.2  烟草病毒RT-PCR扩增片段序列分析

TMV、CMV、PVY和TEV的反转录产物经PCR扩增后，结果显示TMV扩增片段约为237 bp，CMV扩增片段约为273 bp，PVY扩增片段约为456 bp，TEV扩增片段约为347 bp，而健康烟草中均未检测到4种病毒片段的存在（图2）。此外，上述4种病毒的PCR产物克隆测序结果也表明，TMV、CMV、PVY和TEV的扩增产物大小分别为237、273、456和347 bp，片段大小与引物设计预期相符，获得序列与Genebank中各病毒外壳蛋白基因序列比对结果表明，同源性均在98%以上，表明本研究中所用引物对烟草中TMV、CMV、PVY和TEV的检测具有很高的特异性。

2.3  不同病毒种类侵染率及区域分布

表2结果显示，4种烟草病毒在全省分布不均匀，检出率最高的是CMV 89.19%，其余依次为TMV 63.88%、PVY 28.99%和TEV 24.32%。全省各烟区中，洛阳、漯河和南阳地区4种病毒检出率顺序与全省一致，均是CMV>TMV>PVY>TEV;许昌、驻马店地区则是CMV>TMV>TEV>PVY;三门峡地区是CMV>PVY>TMV>TEV;信阳地区TMV与CMV检出率相同，PVY与TEV检出率相同;平顶山、济源地区则是TMV>CMV，且全省只有济源地区未检测到TEV，其他地区均检测到这4种病毒。因此，CMV是河南烟区的优势病毒，且全省不同烟区主要病毒种类及数量均存在差异。

2.4  单一病毒侵染和复合病毒侵染数量及分布

由表3可知，407份疑似病毒侵染的烟草叶片样本分别经4种特异性引物扩增检测后，7份未检测到病毒，样本病毒检出率为98.28%。检测到病毒的400份样本中，有95份被单一病毒侵染，单一病毒侵染率为23.34%，其余305份样本分别被多种病毒侵染，复合侵染率为74.94%，明显高于单一病毒侵染率，由此可知，复合侵染现象在田间普遍发生。复合侵染病毒种类为2、3、4种不等，侵染比例分别为47.17%、22.36%、5.41%，显然，随着复合侵染病毒种类的增多，复合侵染比例逐渐降低。

全省单一病毒侵染类型中CMV所占比例最高，为16.71%（表3），可见CMV是河南烟区的优势病毒。单一病毒侵染种类与数量在全省9个地区中均有差异（图3），许昌地区分别检测到CMV、TMV、PVY和TEV等4种病毒的单一病毒侵染;洛阳、南阳、平顶山、信阳地区分别检测到CMV和TMV两种病毒的单一病毒侵染;三门峡地区分别检测到CMV和PVY两种病毒的单一病毒侵染;漯河地区分别检测到CMV和TEV两种病毒的单一病毒侵染;驻马店地区仅检测到CMV的单一病毒侵染;济源地区仅检测到TMV的单一病毒侵染;且全省除平顶山和济源地区TMV所占比例最高外，其他产区均是CMV居最高。

所有复合病毒侵染类型中CMV+TMV所占比例最高（表3），为36.86%，其次分别为CMV+TMV+PVY和CMV+TEV+PVY，侵染比例均是7.62%。复合侵染类型与数量在产区间也表现不一（图4），其中三门峡地区CMV+TEV+PVY复合侵染比例最高，而驻马店则是CMV+TMV+TEV复合侵染居最多，其他地区CMV+TMV复合侵染比例最高。此外，TMV+PVY仅在洛阳地区检测到，而TMV+TEV+PVY也只在许昌地区检测到。复合侵染类型最多的地区是许昌，多达8种，济源复合侵染类型最少，仅2种，其他产区复合侵染类型4～6种，由此可知，复合侵染现象在田间表现较复杂。

3  讨  论

本研究通过RT-PCR方法对河南烟区4种主要病毒TMV、CMV、PVY和TEV进行检测分析，结果发现河南烟区的优势病毒是CMV。这与之前报道的CMV是河南烟区优势病毒[13-14]结果一致，不同于2018年TMV是河南烟区病毒病优势种的研究结果[3]，显然同一烟区不同年度间病毒病的优势种可能发生变化[16]，该结论同样在云南[2]、湖南[10]、陕西[17]等烟区得到证实。由于TMV经机械传播，烟草种植期间的农事操作和日常管理会影响TMV的发生，而CMV、TEV、PVY经蚜虫非持久性传播，蚜虫发生时间、种群数量、环境因素等均可影响此类病毒的变化。优势病毒可能受到全球气候变化、耕作制度变革、种植品种更替、日常农事操作及传播介体的发生量等诸多因素的影响。

本研究结果表明河南烟区复合病毒侵染广泛发生，复合病毒侵染率达74.94%。之前的研究表明，湖南[10]、云南[9]、陕西[17]、重庆[18]及全国部分烟區[1]复合病毒侵染率均达到60%以上，可知复合病毒侵染成为主要的危害方式，推测原因一是长期连作导致烟株养分吸收量持续降低，病虫害发生加重[19];二是生产上种植品种单一，且缺少抗病品种，从而加重病害的复合侵染[20]，三是很多病毒可通过农事操作传播，尤其是TMV极易接触传播，导致复合侵染加重。本研究表明河南烟区复合病毒侵染类型以CMV+TMV为主，该结果与之前酶联免疫吸附法[3]检测结果一致，同样结果出现在重庆[18]及湖南[10]烟区。本研究还发现随着复合侵染病毒种类的增多，复合侵染比例逐渐降低，时洪伟等[18]、李金岭等[17]、佟爱仔等[2]的研究中也可得出同样结论，但青玲等[1]的研究中5种病毒复合侵染率大于其他2种以上病毒复合侵染率，具体原因还有待分析。

本研究还发现河南不同烟区的优势病毒种类及主要侵染类型均存在差异，可能原因一是检测结果会受到取样时间及取样地点的影响，二是不同地区间的种植品种、土壤类型、气象因素、田间管理等因素的不同均可导致不同病毒病的发生[21-22]。此外，本研究还发现蚜传病毒病CMV、TEV、PVY的发生总量明显大于TMV病毒。因此，在生产过程中防治病毒病时，除因地制宜防治优势病毒及主要侵染类型外，还应兼顾其他病毒种类和复合侵染情况，更重要的是要突出治虫防病，切断病毒病传播途径。本研究尚有7份疑似这4种病毒侵染的样本未检测到病毒，表明这些样品中可能含有其他未检测的病毒种类，因此还需对该部分样品进一步检测。

4  结  论

结果表明，2020年河南烟区407份烟草病毒病样本的病毒检出率为98.28%，其中，CMV是优势病毒。侵染类型中单一病毒侵染率为23.34%，多种病毒复合侵染率为74.94%，复合病毒侵染率远大于单一病毒侵染率，且随着复合侵染病毒种类的增多，复合侵染比例逐渐降低。复合侵染类型主要有CMV+TMV、CMV+TMV+PVY及CMV+TEV+PVY侵染比例分别为36.86%、7.62%、7.62%。本研究同时明确了河南不同烟区的优势病毒种类及侵染类型，为当地病毒病的精准防治提供了理论依据。此外，本研究只检测了TMV、CMV、PVY及TEV 4种病毒，尚有7份疑似表现病毒病症状的未检出该4种病毒，应进一步验证是否受到其他病毒侵染。

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