郑梦迪，张 彦，张 寒，汪兴军

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

根据2020 年版《中国药典》（一部）规定，唇形科植物活血丹Glechoma longituba（Nakai）Kupr 为中药连钱草Glechomae Herba 的唯一正品基原[1]，用药部位是其干燥的地上部分，是我国民间常用中药[2-3]。传统中医学认为连钱草具有利湿通淋、清热解毒、散瘀消肿之功。现代医学研究表明，连钱草具有降糖、降脂溶石、利尿利胆、活血消肿等药用价值[4-7]。植物活血丹在不同地区别名众多，如：连钱草、破铜钱、遍地金钱、金钱草、透骨消、铜钱草、遍地香等[2]。另外，中药材连钱草作为药材使用由来已久，但由于同物异名、同名异物和地方习用品混淆现象复杂，造成在临床上连钱草的基原混乱。“连钱草”名最早出现在《唐本草》中“积雪草”的注文，“叶圆如钱，有蔓延地”引自本草《徐仪药图》，所载“积雪草”泛指伞形科积雪草属植物，并非植物活血丹[8]。另活血丹在华东地区多以“金钱草”冠名[2]，而药材金钱草Lysimachiae Herba 的正品基原是报春花科植物过路黄Lysimachia christinaeHance 的干燥全草，具有利湿退黄、利尿通淋、解毒消肿的功效[1]；民间用药也常有将活血丹与金钱草相混淆的现象[9]。此外由于同名异物现象和地方俗称差异，豆科植物金钱草Desmodium styracifoliumMerr.、玄参科植物羊膜草Hemiphragma heterophyllumWall.、毛茛科植物盾叶唐松草Thalictrum ichangenseLecoy.ex Oliv.、唇形科植物宝盖草Lamium amplexicauleL.、伞形科植物积雪草Centella asiatica（L.）Urban.及天胡荽Hydrocotle sibthorpioiedsLam.等，也常与活血丹混淆[10]。

上述植物品种间性状多有相似，且中药材几乎都需要经过炮制才可作为饮片销售，加工过后鉴别特征常常消失，且易受采收时间和环境因素等影响，为传统的鉴定方法带来了极大的挑战。随着中药材贸易流通的便捷，不同省份的药材品种流通增多。不同“连钱草”或“金钱草”基原物种的主要活性成分和含量均有一定的差异，若不做区分应用，对临床用药的安全性和有效性具有一定的隐患。因此，亟需开发一种能够快速准确鉴别药用正品、地方习用品及其常见混淆品的技术。而DNA 条形码技术具有简便、微量、特异性强的特点，为活血丹及其地方习用品的鉴别提供了新的方法和思路[11-13]。近年来基于ITS2 基因条形码可迅速准确对多种植物进行物种鉴定，验证了其条形码的适用性和稳定性[14-16]。ITS2 rDNA 的二级结构是由ITS 一级结构自身回折而形成的茎环结构[17]，ITS2 二级结构对RNA 的功能具有重要影响，既包含系统发育信息，又可以避免或排除旁系同源或假基因对于系统发育树构建的误导。在物种鉴定研究时，ITS2 二级结构信息是对一级结构的有效补充[18-19]。本研究基于ITS2 的一级结构和二级结构对活血丹及其易混淆品种进行分子鉴别，旨在探讨DNA 条形码在中药材连钱草与其地方习用品及易混品鉴别中的应用，为连钱草正品与易混品的鉴别提供准确有效的标准。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究材料来源见表 1，包括植物样本和GenBank中的ITS2 序列，本研究包含活血丹、金钱草、盾叶唐松草、羊膜草、宝盖草、积雪草、过路黄和天胡荽，共8 个物种的51 条ITS 序列。其中，活血丹9 个植物样本、4 条GenBank 序列，共13 条序列；金钱草、盾叶唐松草、羊膜草、宝盖草、积雪草、过路黄、天胡荽分别为：6、6、6、6、7、4、3 条序列。实验样本由西安医学院生药教研室张彦副教授鉴定，样本保存于药学综合实验室-80℃冰箱。

表1 本研究中活血丹及其易混品的样本及GenBank 数据库中ITS2 序列信息Tab.1 Samples and ITS2 GenBank sequences included in this study among Glechoma longituba and its adulterants

1.2 基因组总DNA 的提取

取经干燥处理的植物叶片约2 g，在液氮环境中快速研磨成粉状，使用高效植物基因组DNA 提取试剂盒DP350-02 提取总DNA，按说明书进行操作。

1.3 PCR 体系的建立与测序

扩增ITS2 序列的引物：ITS2F: 5’-ATCGATGCG ATACTTGGTGTGAAT-3’、ITS3R：5’-ATCGGACG CTTCTCCAGACTACAAT-3’。PCR 反应按25 μL 扩增体系进行：2 × Taq PCR Mix 12.5 μL，通用引物ITS2F 和ITS3R 均选用浓度10 μmol/L 各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序为：94 ℃变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40 个循环；72 ℃延伸2 min；16 ℃ forever。PCR 产物送往西安擎科创新生物科技有限公司进行Sanger双向测序。

1.4 ITS2 序列的获得和比对

采用CodonCode Aligner V 3.0.1（CodonCode Co.，USA）软件校对拼接测序后所得序列峰图[20]；另外，从GenBank 下载8 个分类群，即活血丹、金钱草、盾叶唐松草、羊膜草、宝盖草、积雪草、过路黄和天胡荽的ITS 序列，并利用其Blast 功能排除可疑序列。而后应用ITS2 Database（http://its2.bioapps.Biozen trum.uni-wuerzburg.de/）基于隐马尔可夫模型HMMer[21]注释方法分析并去除两端5.8S 和28S rDNA 区段，获得ITS2 片段。利用ClustalW 软件比对所有ITS2 序列。利用ITS2 Database 预测获得各物种的ITS2 二级结构。

1.5 遗传距离计算和一级结构进化树构建

采用MEGA7 软件[22]分析比对所有ITS2 序列，基于K2P（Kimura 2-parameter）算法计算种内、种间遗传距离，构建NJ 聚类树，Bootstrap 1 000 次重复检验分支系统发育的可靠性。统计GC 含量、变异位点和简约信息位点等特征信息。

1.6 一级结构和二级结构联合系统发育树的构建

利用ITS2 Database[23]获得核酸序列和二级结构的联合矩阵，将所有样本的联合矩阵输入4Sale 软件[24]中进行比对，将比对好的结果导入ProfDIstS 软件[25]构建剖面邻接PNJ（Profile neighbor joining）系统发育树，Bootstrap1 000 次检验各分支置信度。

2 结果

2.1 PCR 扩增效率及测序成功率

对植物样本（活血丹）的 ITS2 序列分析发现，PCR 扩增及测序成功率均为100%，经0.8%琼脂糖凝胶电泳得到PCR 扩增电泳图，扩增效果较好，条带较亮，没有拖尾现象。扩增序列长度范围在300 ～500 bp，见图 1。

图1 ITS2 序列的电泳图谱Fig.1 Electrophoretogram of ITS2 sequences of samples

2.2 ITS2 序列特征及差异

本研究对活血丹及其易混品种的ITS2 序列特征进行分析，见表2。实验中51 条序列的ITS2 序列长度为213 ～ 237 bp，GC 含量为57.36% ～ 73.1%。MEGA7.0 多重序列比对后序列长254 bp。12 个活血丹样本的ITS2 序列长度为213 bp，GC 含量为67.6%，种内无变异位点。7 个积雪草样本的ITS2 序列长234 bp，种内存在2 个变异位点，GC 含量为71.7%，种内存在1 个简约信息位点。6 个盾叶唐松草样本种内存在4 个变异位点。6 个羊膜草和6 个样本宝盖草种内变异位点分别为3 个和1 个，简约信息位点均为1 个。过路黄、金钱草和天胡荽序列GC 含量分别为57.6%、57.8%和63.6%，种内变异位点个数分比为3 个、0 个和1 个。

表2 活血丹及其易混淆品的ITS2 序列特性Tab.2 ITS2 sequences characteristics of Glechoma longituba and its adulterants

2.3 种内和种间K2P 遗传距离分析

本实验通过MEGA7 软件，基于K2P 模型分析各样本的种内种间遗传距离，见表3。所有样本种内遗传距离0 ～ 0.017，活血丹种内遗传距离0，过路黄种内遗传距离最大为0.017，活血丹、盾叶唐松草、羊膜草、宝盖草、积雪草、过路黄、金钱草、天胡荽的种内平均遗传距离分别是0.000、0.004、0.005、0.003、0.005、0.009、0.000、0.004。活血丹与盾叶唐松草、羊膜草、宝盖草、积雪草、过路黄、金钱草、天胡荽的种间遗传距离分别是0.522、0.315、0.269、0.377、0.527、0.758、0.499。种间最小遗传距离是活血丹和羊膜草0.315。种间最小距离（0.315）大于种内最大遗传距离（0.017），不同种植物之间存在一个明显的“Barcoding Gap”。因此ITS2 一级序列可以区分开药材连钱草正品和其它易混品种。

表3 本研究中样本种内和种间遗传距离Tab.3 Genetic distances of all samples

2.4 聚类分析

基于ITS2 序列（一级结构）和基于ITS2 一级结构与二级结构联合矩阵，分别构建系统发育树，所得拓扑关系基本一致。基于ITS2序列构建的NJ邻接树，见图2A，活血丹、盾叶唐松草、羊膜草、宝盖草、积雪草、过路黄、金钱草、天胡荽分别聚为一支，自展支持率均达99%，8 种植物可明显区分开。基于ITS2一级结构与二级结构联合矩阵所构建的PNJ 进化树所得分支拓扑结果与NJ 树一致，即各物种各自聚为一个分支，呈现出良好的单系性，而且末端分支分类水平的准确率有所提高，见图2B。因此，二级结构信息位点的加入可以对一级信息进行补充和验证。

图2 所有分类群的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of all taxa

2.5 ITS2 二级结构分析

活血丹及其易混品种植物的ITS2 二级结构，见图3。所有物种ITS2 二级结构均呈“一环四臂”形态，其中，臂III 最长；但同时，各种间ITS2 二级结构均有较大差异，差异主要体现在主环大小、旋臂长度、旋臂间夹角、茎环数目大小及位置等方面。活血丹包含7 个内环、1 个多分支环、4 个发卡环结构；与其关系最近的羊膜草在臂I 和臂IV 之间有一段单链结构，中间的主环相对较大且富含嘌呤，共有5 个内环、1 个多分支环和4 个发卡环。宝盖草、盾叶唐松草、过路黄、天胡荽的臂I 和臂IV 之间均有单链结构但大小不同、臂的长度和位置及环的数量各有差异。金钱草的主环最大，而臂IV 的长度明显小于积雪草，且内环的数量、位置及臂的夹角均不同。因此，通过ITS2 二级结构的分子形态差异也可以准确地鉴别连钱草与其易混品种。

图3 所有分类群的ITS2 二级结构图Fig.3 ITS2 secondary structure of all taxa

3 讨论

连钱草在我国用药历史悠久，但作为一种典型的同名异物药材，其基原的品种混淆现象长期存在。传统的以植物表型为基础的鉴别方法受到多因素的影响，且对鉴定者的植物学知识及实践工作经验要求高，获得的结果容易引起争议。而DNA 条形码技术不依赖于中药材基原的表型特征，ITS2 是药用植物鉴定中常用的DNA 条形码之一，对属以下级别同样具有较高的鉴定效率[13]。因此，本研究比较了药材连钱草的正品基原——活血丹与其常见易混品的K2P 遗传距离，结果显示：活血丹与金钱草这两种植物常被当做药材金钱草在华东地区使用，二者种间遗传距离最大，其次分别是过路黄、盾叶唐松草、天胡荽、积雪草、羊膜草，与宝盖草的种间遗传距离最小；宝盖草与活血丹同属于唇形科植物，因此二者遗传距离最相近与植物的分类相符。由ITS2一级序列构建的NJ 树，可以观察到不同物种均独立分支，呈现出良好的单系性，即ITS2 一级序列可将连钱草与本研究中的易混品区分开。在细胞中，ITS2 一级序列经过折叠形成二级结构后才具备生物学功能，在参与生命过程中发挥重要作用，其二级结构若发生变化，将直接影响核糖体转录过程[26]。大量研究表明，尽管ITS2 的一级核酸序列变化迅速，但其二级结构在整个真核生物群中高度保守[27]。二级结构有助于指导一级核酸序列的比对，并在本研究中起到校正作用。因此，本研究在ITS2 核酸序列的基础上，对活血丹及其混淆品种的二级结构进行了预测，并且构建了ITS2 一级序列和二级结构联合矩阵的PNJ 系统进化树。结果表明，活血丹与其混淆品种的ITS2 二级结构在旋臂长度、旋臂间夹角、颈环大小、数目和位置等方面存在较大差异；此外，ITS2 一级序列和二级结构联合矩阵构建的PNJ 发育树展示出各物种的拓扑关系与NJ 树一致，并且各分支的支持率进一步提高。

4 结论

本研究从分子水平探讨了中药连钱草与其易混淆品及地方习用品的系统发育关系，表明ITS2 可用于准确快速鉴别中药材连钱草与其地方习用品及易混淆品种，为连钱草用药的准确性和有效性提供了一定保障，为连钱草药材市场的规范化提供了参考。同时也为连钱草的科学研究、药品研发和健康产品开发等提供了一定参考依据；并从DNA 水平探索不同品种的亲缘关系，从而为发现可以替代连钱草的植物资源提供了新思路和方法，为扩大药源和选育新品种等方面的研究提供了理论依据。