薛迪 刘学伟 汪娜 刘宇超 徐涛 裴芳艺

中圖分类号 R965 文献标志码 A 文章编号 1001-0408（2022）05-0597-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.15

摘 要 目的 研究芥子酸对β-淀粉样蛋白42（Aβ42）诱导PC12细胞损伤的改善作用及机制。方法 将PC12细胞分为对照组、模型组、芥子酸组、激活磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）抑制剂组、细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）抑制剂组，各抑制剂组先分别加入LY294002和U0126（均为10 μmol/L）培养1 h;然后除对照组外，其余4组分别加入2 μmol/L Aβ42处理24 h以复制阿尔茨海默病细胞模型;除对照组及模型组外，其余3组再分别加入100 μmol/L 芥子酸，继续培养 24 h。检测细胞存活率并观察其形态，检测细胞中Aβ42含量、cAMP反应元件结合蛋白（CREB）mRNA表达水平以及环磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）、CREB、磷酸化CREB（p-CREB）蛋白表达水平。结果 经芥子酸作用后，PC12细胞存活率、细胞中CREB mRNA表达水平以及cAMP、PKA、p-CREB 蛋白表达水平均显著升高（P<0.05），细胞中Aβ42含量显著降低（P<0.05），细胞形态明显改善、突触增多;而经 PI3K、ERK抑制剂干预后，PC12细胞存活率及上述mRNA和蛋白表达水平均被显著逆转（P<0.05或P<0.01），细胞形态不规则、碎片增多，且突触连接减少。结论 芥子酸可升高Aβ42诱导损伤的PC12细胞存活率，改善细胞形态，降低细胞中Aβ42含量，其作用机制可能与促进细胞中CREB mRNA转录、激活cAMP/PKA/CREB信号通路有关。

关键词 芥子酸;cAMP/PKA/CREB信号通路;阿尔茨海默病;β-淀粉样蛋白

Improvement effects of sinapic acid on Aβ42-induced injury of PC12 cells and the mechanism

XUE Di1，LIU Xuewei2，WANG Na3，LIU Yuchao4，XU Tao1，PEI Fangyi4（1. School of Pharmacy， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 2. School of Mental Health，Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 3. School of Basic Medicine， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 4. Office of Academic Research， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China）

ABSTRACT   OBJECTIVE To study the improvement effects of sinapic acid on Aβ42-induced injury of PC12 cells and the mechanism. METHODS PC12 cells were divided into five groups： control group， model group， sinapic acid group， phosphoinositide- 3-kinase （PI3K） inhibitor group and extracellular signal-regulated kinase （ERK） inhibitor group. Each inhibitor group was added with LY294002 and U0126 （10 μmol/L） for 1 h; except for control group， other four groups were treated with 2 μmol/L Aβ42 for 24 h to replicate the Alzheimer’s disease cell model; except for control group and model group， other three groups were added with 100 μmol/L sinapic acid respectively. After 24 hours of continuous culture， survival rate of PC12 cells was detected and the morphology of PC12 cells was observed. The content of Aβ42， mRNA expression of cAMP response element binding protein （CREB）， protein expression of cyclic adenosine monophosphate （cAMP）， protein kinase A（PKA）， CREB signaling pathway and phosphorylated CREB （p-CREB） were detected. RESULTS After treated with sinapic acid， the survival rate of PC12 cells， mRNA expression of CREB and protein expressions of cAMP， PKA and p-CREB were increased significantly （P<0.05）， while the content of Aβ42 was decreased significantly （P<0.05）; cell morphology was significantly improved and synapses increased. After intervened with PI3K and ERK inhibitors， the survival rate of PC12 cells， above mRNA and protein expressions were reversed significantly （P<0.05 or P<0.01）; cell morphology was irregular， the fragments increased， and the synaptic connections decreased. CONCLUSIONS Sinapic acid can improve the survival rate of PC12 cells injured by Aβ42， improve cell morphology and decrease the content of Aβ42， the mechanism of which may be associated with  promoting the gene transcription of CREB， and activating cAMP/PKA/CREB signaling pathway.

KEYWORDS   sinapic acid;cAMP/PKA/CREB signaling pathway; Alzheimer’s disease; β-amyloid protein

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是与年龄高度相关的中枢神经系统退行性疾病，该疾病的症状始于轻度的记忆困难，并逐渐发展为认知障碍和日常活动功能障碍，现已成为严重威胁人类生命健康的重大疾病之一[1]。AD的神经病理学特征包括一些异常蛋白的积累，如淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein）的分裂导致β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）沉积形成老年斑，使得突触丢失，造成神经退行性病变[2-3]，其中Aβ40在AD的发病机制具有保护作用，而Aβ42具有致病作用[4]。因此，抑制Aβ42的神经毒性已成为现代AD领域研究热点，找到能够抑制Aβ42神经毒性的药物对有效预防和治疗AD具有重要意义。

芥子酸及其衍生物canolol、芥子碱、丁香醛等对AD、帕金森病、共济失调、重症肌无力等均有一定的治疗功效[5]。本课题组前期研究发现，大鼠灌胃中药远志后，在其脑脊液成分中检测出芥子酸;灌胃开心散后，在其血液中检测出远志糖酯类化合物 tenuifoliside A，该化合物与芥子酸存在相似的基本母核，并可以提高大鼠海马神经元的存活率。相关研究发现，芥子酸对Aβ1-42诱导的PC12细胞损伤具有保护作用，其作用机制可能与激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成激酶3β（phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B/glycogen synthase kinase 3β，PI3K/Akt/GSK3β）和脑源性神经营养因子/酪氨酸激酶B/细胞外信号调节蛋白激酶（brain-      derived neurotrophic factor/tyrosine kinase B/extracellular signal-regulated kinase，BDNF/TrkB/ERK）等信号通路有关[6-9]。这提示芥子酸在治疗神经退行性疾病方面具有一定作用。另有相關研究发现，PI3K/Akt/GSK3β和BDNF/TrkB/ERK信号通路下游的环磷酸腺苷/蛋白激酶A/cAMP 反应元件结合蛋白（cyclic adenosine monophosphate/protein kinase A/cAMP response element binding protein，cAMP/PKA/CREB）信号通路也是大脑内重要的信号通路之一，对神经元的存活与分化、突触的形成等均具有重要作用[10]。

在本课题组前期研究的基础上，本研究以具有神经细胞特性的PC12细胞作为研究对象，用Aβ42 诱导该细胞损伤以制备AD的体外模型，然后研究芥子酸对Aβ42诱导PC12细胞损伤的改善作用，并基于cAMP/PKA/CREB信号通路探讨其作用机制，以期为芥子酸防治AD提供实验依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有Series 8000型CO2培养箱、QuantStudio 5型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），DL-CJ-2NDII型超净工作台（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），CKX41-A32PH型倒置显微镜（日本Olympus公司），M200 PRO型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），5804R型离心机（德国Eppendorf公司），S11-6-S型恒温水浴锅（上海跃进医疗器械有限公司），LDZH-200KBS型高压蒸汽灭菌器（上海申安自动化系统工程公司），C1000 Touch 型基因扩增仪、165-8001型电泳仪、1703811型电转仪、Gel Doc XR型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

1.2 主要药品与试剂

本研究所用主要药品与试剂有芥子酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，纯度≥97%，批号S30697）;Aβ42（北京博奥森生物技术有限公司，批号bs-0107p）;胎牛血清（美国BI公司，批号04-007-1A）;RPMI 1640培养基（美国HyClone公司，批号SH30809.01）;胰蛋白酶、青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为TB150、P1400）;LY294002对照品（纯度100%）、U0126对照品（纯度100%）、CCK-8试剂盒（美国AbMole公司，批号分别为15447-36-6、109511-58-2、M4839）;大鼠Aβ42酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司，批号 E02A0050）;焦碳酸二乙酯（DEPC）、ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为ST036、P0018AS）;兔源PKA多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号24503-1-AP）;兔源cAMP 多克隆抗体（美国Abcam公司，批号ab76238）;兔源CREB多克隆抗体、兔源磷酸化CREB（p-CREB）多克隆抗体（美国CST公司，批号分别为9197、9198）;鼠源β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分别为151218、122826、122011）。PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司设计、合成（具体引物序列及扩增产物长度见表1）。其余试剂为实验室常用规格，水为去离子水。

1.3 细胞

大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞（高分化）由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

2 方法

2.1 PC12细胞的培养

将PC12细胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基（以下简称“培养基”）中，于5%CO2、37 ℃、饱和湿度的培养箱中培养，每2～3 d 换液1次，待细胞呈单层贴壁状并进入对数生长期时，用于后续实验。

2.2 Aβ42溶液的制备

将1 mg Aβ42溶解于221.5 μL去离子水中，制成浓度为1 000 μmol/L的溶液，然后置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，以制备Aβ42寡聚体[9]，于-20 ℃保存，备用。

2.3 分组

根据本课题组前期MTT实验发现，Aβ42诱导PC12细胞损伤的最适浓度为2 μmol/L，芥子酸的最适给药浓度为100 μmol/L[8-9]。根据文献[11-12]报道，处理PC12细胞时，PI3K抑制剂LY294002和ERK抑制剂U0126的最适给药浓度为均为10 μmol/L。本研究分组如下：对照组、模型组（Aβ42 2 μmol/L）、芥子酸组（Aβ42 2 μmol/L+芥子酸100 μmol/L）、PI3K抑制剂组（Aβ42 2 μmol/L+芥子酸100 μmol/L+LY294002 10 μmol/L）、ERK抑制剂组  （Aβ42 2 μmol/L+芥子酸100 μmol/L+U0126 10 μmol/L）。

2.4 PC12细胞存活率检测及形态观察

采用CCK-8法进行检测。取对数生长期PC12细胞，调整细胞密度为 1×105 mL-1，接种于 6 孔板中，每孔1.5 mL，按“2.3”项下方法分组，另设仅加入细胞培养基的空白组，每组设置8个复孔。培养24 h后，PI3K抑制剂组、ERK抑制剂组先加入LY294002、U0126培养1 h;然后除对照组外，其余4组分别加入2 μmol/L Aβ42继续培养24 h以造模;除对照组及模型组外，其余3组再分别加入100 μmol/L 芥子酸继续培养24 h后，置于倒置显微镜下观察并拍照;随后加入10 μL CCK-8试剂，继续培养4 h，采用酶标仪于 450 nm波长下检测各孔吸光度（OD）值，并计算细胞存活率[细胞存活率=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%]。

2.5 PC12细胞中Aβ42含量检测

采用ELISA法进行检测。取对数生长期PC12细胞，按“2.4”项下方法分组、造模与给药，每组设3个复孔。于细胞培养结束后，弃原培养基，以PBS清洗细胞1遍，用胰酶消化后，加入培养基终止消化，以1 000 r/min离心5 min，收集细胞;以PBS清洗3遍后，重悬细胞，采用超声法裂解细胞，以5 000 r/min离心15 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书方法操作，测定PC12细胞中Aβ42的含量。

2.6 PC12细胞中CREB mRNA表达水平检测

采用PCR 法进行检测。取对数生长期PC12细胞，按“2.4”项下方法分组、造模与给药，每组设3个复孔。于细胞培养结束后，按 RNAiso Plus试剂盒说明书方法操作提取各组细胞的总RNA，逆转录合成cDNA模板，再进行PCR反应。PCR反应体系包括cDNA 10 μL、PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1 μL、RT Primer Mix 1 μL、5×PrimeScript Buffer 4 μL、RNase Free dH2O 4 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s，60 °C退火延伸34 s，共40个循环。反应结束后，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达水平（以对照组为“1”计算其余组相对值）。实验重复3次。

2.7 PC12细胞中cAMP、PKA、CREB、p-CREB 蛋白表达水平检测

采用Western blot法进行检测。取对数生长期PC12细胞，按“2.4”项下方法分组、造模与给药，每组设3个复孔。于细胞培养结束后，收集细胞，提取细胞总蛋白;采用BCA法测定总蛋白含量，并制备蛋白样品。将蛋白样品加至聚丙烯酰胺凝胶中，以恒压（电压110 V）电泳进行分离，再以恒压（电压75 V，2 h）进行转膜，以5%BSA 封闭液封闭 1 h，加入cAMP、PKA、CREB、p-CREB一抗（稀释度均为1 ∶ 800）及β-actin一抗（稀釋度为1 ∶ 1 000），于4 ℃过夜;以TBST溶液清洗3次，每次 5 min，加入二抗（稀释度为1 ∶ 1 000），于 37 ℃条件下反应 1 h;以TBST 溶液清洗 3 次，每次 5 min，以 ECL 显色后，采用凝胶成像系统曝光成像。采用Image Lab 4.0.1 图像分析软件进行分析，以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示目的蛋白表达水平（以对照组为“1”计算其余组相对值）。实验重复3次。

2.8 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 芥子酸对PC12细胞存活率及形态的影响

与对照组比较，模型组PC12细胞存活率显著降低（P<0.05）;与模型组比较，芥子酸组PC12细胞存活率显著升高（P<0.05）;与芥子酸组比较，PI3K抑制剂组和ERK抑制剂组PC12细胞存活率均显著降低（P<0.05）。结果见表2。

经显微镜观察后发现，对照组细胞贴壁良好，饱满且边缘清晰，可见长短不一的突触，细胞间连接紧密。模型组细胞数量较对照组明显减少，且细胞形态趋于圆形，突触变短、变少，并伴有大量碎片。芥子酸组细胞形态明显改善，突触增多，且与对照组形态相似。而与芥子酸组比较，PI3K抑制剂组和ERK抑制剂组细胞形态不规则，碎片增多，且突触连接减少。结果见图1。

3.2 芥子酸对PC12细胞中Aβ42含量的影响

与对照组比较，模型组PC12细胞中Aβ42含量显著升高（P<0.05）;与模型组比较，芥子酸组PC12细胞中Aβ42含量显著降低（P<0.05）;与芥子酸组比较，PI3K抑制剂组和ERK抑制剂组PC12细胞中Aβ42含量均显著升高（P<0.05）。结果见表3。

3.3 芥子酸对PC12细胞中CREB mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组PC12细胞中CREB mRNA表达水平显著降低（P<0.05）;与模型组比较，芥子酸组PC12细胞中CREB mRNA表达水平显著升高（P<0.05）;与芥子酸组比较，PI3K抑制剂组和ERK抑制剂组PC12细胞中CREB mRNA表达水平均显著降低（P<0.05）。结果见表4。

3.4 芥子酸对PC12细胞中cAMP、PKA、CREB、p-CREB 蛋白表达的影响

各组PC12细胞中CREB蛋白表达水平均无显著差异（P>0.05）。与对照组比较，模型组PC12细胞中cAMP、PKA、p-CREB 蛋白表达水平均显著降低（P<0.05）;与模型组比较，芥子酸组PC12细胞中cAMP、PKA、p-CREB 蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）;与芥子酸组比较，PI3K抑制剂组和ERK抑制剂组PC12细胞中cAMP、PKA、p-CREB蛋白表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）。结果见表5、图2。

4 讨论

近年研究发现，芥子酸可改善Aβ42或氰化钾诱导的小鼠认知障碍，抑制CO2或东莨胆碱引起的大鼠认知障碍，减轻Aβ42或红藻氨酸造成的海马神经元损伤[13-15]。细胞内Aβ含量随着AD患者年龄的增长而增加，其在体内累积可以导致AD患者神经元突触损伤[16]。因此，加速Aβ降解、减少Aβ沉积，已成为防治AD的主要方法之一。

本研究结果显示，芥子酸可显著提高Aβ42诱导的PC12细胞存活率，改善细胞形态;经 PI3K抑制剂LY294002和ERK抑制剂U0126干预后，PC12细胞存活率下降，细胞形态发生改变，细胞碎片增多，且突触连接减少。采用ELISA法检测PC12细胞中Aβ42含量发现，芥子酸可显著降低PC12细胞中Aβ42含量;而经PI3K抑制剂LY294002和ERK抑制剂U0126干预后，PC12细胞中Aβ42含量升高。这表明芥子酸能够降低PC12细胞中Aβ42的含量，但当PI3K和ERK信号通路被阻断后，芥子酸这一降低作用受到抑制。

研究指出，BDNF与TrkB结合后可介导丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases，MAPK）/ERK、PI3K/Akt、磷脂酶C等信号通路，这些信号通路与神经分化及神经营养密切相关，可直接调控细胞的增殖与分化，同时还能促进CREB蛋白的磷酸化，在神经系统相关疾病中具有重要作用[10，17]。 cAMP/PKA/CREB 信号通路是脑内重要信号通路之一，对长时程记忆的形成起到关键作用：cAMP是一种核苷酸衍生物，为细胞的第二信使，具有促进突触传递、记忆形成及神经元存活的作用;PKA可参与神经递质的合成与释放，诱导CREB基因转录和蛋白合成，促进神经元存活、分化及生长发育[18];CREB是PI3K/Akt和MAPK/ERK通路的下游信号分子，当其磷酸化后，可诱导BDNF的产生，激活PI3K/Akt信号通路，诱导cAMP反应序列基因表达，减少神经元调亡，从而改善AD患者的认知障碍[19-20]。另有文献报道，ERK的活化可诱导CREB发生磷酸化，磷酸化后的CREB又进一步诱导cAMP反应序列基因表达，从而改善AD患者的认知障碍[21-22]。

本研究结果显示，模型组PC12细胞中CREB mRNA 表达水平显著低于对照组，而经芥子酸作用后，细胞中CREB mRNA 表达水平显著升高;但是经PI3K抑制剂LY294002和ERK抑制剂U0126干预后，细胞中CREB mRNA 表达水平均显著降低。这表明芥子酸对PC12细胞损伤的改善作用与促进CREB mRNA转录有关。进一步研究发现，经芥子酸作用后，PC12细胞中cAMP、PKA、p-CREB蛋白表达水平均显著升高;但是经PI3K抑制剂LY294002和ERK抑制剂U0126干预后，细胞中上述蛋白表达水平则显著降低。这表明芥子酸对PC12细胞損伤的改善作用与升高cAMP、PKA蛋白的表达水平，促进CREB蛋白的磷酸化有关。

综上所述，芥子酸可升高Aβ42诱导损伤的PC12细胞存活率，改善细胞形态，降低细胞中Aβ42含量，其作用机制可能与促进细胞中CREB mRNA转录、激活cAMP/PKA/CREB信号通路有关。

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