李菁雯，杨 帆，崔 强，张鹏飞，聂芝君，陈少博

（1.二连海关技术中心，二连浩特 011100；2.呼和浩特海关技术中心，呼和浩特 010018）

马驽巴贝斯虫病（Babesia caballi）属于马梨形虫病的一种，由寄生于马、驴、骡、斑马等马属动物红细胞内的血液原虫引起[1,2]，被世界动物卫生组织（Office international dés epizooties,OIE）列为法定报告检疫疫病，在我国被列为二类动物疫病。该病在欧洲南部地区、中东地区、非洲、亚洲、南美洲均有发生，广泛存在于世界各地[3,4]；在我国新疆维吾尔族自治区、内蒙古自治区、吉林省、甘肃省、河北省、广东省、贵州省等均有报道，发病率为20%～77.6%[5-8]。蜱虫是该病最主要的中间宿主，也是马驽巴贝斯虫病的主要传播者[9]。该病临床表现为体温升高、精神沉郁、肌肉振颤、呼吸和脉搏加速等症状[4,10]，慢性病例耐过后体内会长期带虫，急性病例严重时会发生死亡。随着“一带一路”和“中蒙俄经济走廊”的建设，内蒙古自治区和新疆维吾尔自治区等北部地区正大力发展马产业，马产业已成为地区性的朝阳产业。但近年来，马驽巴贝斯病的发生，给马养殖业造成了严重的危害，也对国际马匹进出口贸易产生了很大的影响。本研究基于我国检疫工作的实际需要，旨在建立两种实用、便捷、高效的马驽巴贝斯虫的分子生物学检测方法。

1 材料与方法

1.1 样本来源 马驽巴贝斯虫（B.caballi）、马巴贝斯虫（B.equi）、环形泰勒虫（T.annulata）等阳性DNA由新疆农业大学动物医学学院实验室提供，33份马的血液临床样品采自蒙古国。

1.2 引物探针的设计及合成 参考马驽巴贝斯虫Bc48特异性基因序列（GenBank登录号：MG94 8457.1）保守区，应用Beacon Designer 7软件设计了一对特异性引物和荧光探针，由生工生物工程（上海）有限公司代为合成。BBS-F：5′-CTCTCCAAAGTCTTAAGTAC-3′；BBS-R：5′-CAGCAGATTGAAGACTAAG-3′；BBS-P：5′-FAM-TGAGGCTAAGTACCAACCGCTGTAMRA-3′。

1.3 标准品制备 利用本研究所设计的引物，根据确定的阳性DNA进行PCR扩增，将PCR产物利用胶回收试剂盒进行回收和纯化，将纯化后的PCR产物与pEASY-T1载体相连接，然后转入感受态细胞E.coli DH5α中，将其置于含有氨苄青霉素的LB固体培养基中过夜培养，再挑取白色单菌落接种于含有氨苄青霉 素的LB液体培养基中纯化培养，提取阳性质粒进行PCR鉴定，并送测序进行分析。

1.4 PCR方法及qPCR方法的建立

1.4.1 PCR方法 PCR反应体系为：2×Premix Taq预混液20 µL，上、下游引物各1 µL，DNA模板1 µL，ddH2O补齐至40 µL。反应条件为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s；58℃退火1 min，35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。用3%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测。

1.4.2 qPCR方法 荧光定量PCR反应体系组成为：2×Premix Ex TaqTM预混液12.5 µL，上、下游引物及探针各1 µL，模板DNA 1 µL，ddH2O补齐至 2 5 µL。反应条件为：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，58℃退火1 min，45个循环；退火延伸时读取荧光信号值。

1.5 PCR及qPCR特异性试验 分别以马驽巴贝斯虫、马巴贝斯虫、环形泰勒虫和健康马血清样品的DNA为模板，空白对照中加入无菌ddH2O，用本研究建立的PCR和qPCR方法进行扩增，评价该方法的特异性。

1.6 PCR及qPCR灵敏性试验 用已测定好浓度（17.4 ng/μL）的马驽巴贝斯虫阳性质粒为模板，对该阳性质粒进行10倍梯度稀释，即4.04×109copies/μL～4.04×100copies/μL，用本研究建立的PCR和qPCR方法对稀释后的样品进行扩增，检测该方法的灵敏性。

1.7 荧光定量PCR稳定性试验 选取5个浓度梯度（4.04×108copies/μL～4.04×104copies/μL）的阳性标准品进行重复性试验，每个梯度的样本20个平行进行检测，根据扩增反应的Ct值，计算变异系数（CV），评价试验的稳定性。

1.8 PCR和qPCR检测方法的比较 应用建立好的PCR方法和qPCR检测方法，分别对33份采自蒙古国马的血液临床样品进行检测。

2 试验结果

2.1 重组质粒鉴定及序列比对结果 提取质粒后，进行PCR扩增试验，用3%琼脂糖凝胶进行电泳检测，可观察到一条约为200 bp的特异性条带，与预期片段大小一致，将重组质粒送至生工生物工程（上海）有限公司进行测序，测序结果与目的片段（GenBank登录号：MG948457.1）比较，相似性为99%，说明重组质粒构建成功。扩增结果见图1。

图1 重组质粒PCR鉴定结果Fig.1 Identification of recombinant plasmid by PCR

2.2 特异性试验结果

2.2.1 PCR特异性试验结果 PCR扩增结果显示，驽巴贝斯虫有大小为200 bp的特异性条带，与目的片段相符（图2）。条带清晰无引物二聚体和非特异性扩增产物出现，其他虫种均无条带出现，说明建立的方法对驽巴贝斯虫具有良好的特异性。

图2 PCR特异性试验结果Fig.2 The result of specificity experiment

2.2.2 qPCR特异性试验结果 实时荧光定量PCR扩增结果显示，驽巴贝斯虫有特异性曲线（图3）。马巴贝斯虫、环形泰勒虫和健康马血清样品均无曲线出现，说明建立的实时荧光定量PCR方法对驽巴贝斯虫有良好的特异性。

图3 实时荧光定量PCR特异性扩增曲线图Fig.3 Specificity test curve of fluoresce quantitative PCR

2.3 灵敏性试验结果

2.3.1 PCR灵敏性试验结果 PCR扩增结果可见，第1～8泳道均能观察到目的片段，且条带亮度依次减弱，条带宽度依次变窄，说明模板DNA浓度依次降低，当模板DNA倍比稀释至4.04×102copies/µL时，即第8泳道，仍有扩增条带（图4）。结果显示，建立的PCR方法所能检测到的最低检出限为4.04×102copies/µL。

图4 PCR灵敏性试验结果Fig.4 The result of sensitivity experiment

2.3.2 qPCR灵敏性试验结果 如图5所示，曲线对应的模板浓度分别为4.0 4×109copies/μL～4.04×100copies/μL，随着模板DNA浓度依次降低，扩增曲线Ct值依次增大。当模板浓度为4.04×101copies/μL时，仍有Ct值和标准的S型曲线，因此，本实验所建立的qPCR方法能够检出的最低浓度为4.04×101copies/μL。利用每个浓度对应的Ct值建立线性关系，从而得到标准曲线回归方程为：y=-3.263x+39.79，相关系数为：R2=0.999，模板浓度与Ct值呈现良好的线性关系。

图5 qPCR灵敏性扩增曲线图Fig.5 Sensitivity test curve of fluoresce quantitative PCR

2.4 qPCR稳定性试验结果 选取5个浓度梯度（4.04×108copies/μL～4.04×104copies/μL）的阳性标准品进行重复性试验，根据扩增反应的Ct值，计算变异系数（CV），评价试验的稳定性。结果如表1所示，5个浓度对应Ct值的变异系数较小，表明所建立的方法具有较好的稳定性。

表1 荧光定量PCR组内重复性试验Table 1 The inter-assay reproducibility test of fluoresce quantitat ive PCR

2.5 PCR方法和qPCR方法在临床中的应用比较 对33份采自蒙古国的临床样品分别应用建立的PCR方法及qPCR检测方法进行检测，结果显示PCR方法检测的阳性样品数为9，阳性率为27.3%（9/33）；qPCR方法检测的阳性样品数为 23，阳性率为69.7%（23/33），经卡方检验，两种方法的阳性率有着极显著性差异（P＜0.01，x2=10.25），说明本试验所建立的qPCR检测方法比PCR方法灵敏性更好，效果更优。

3 讨论

近年来，马驽巴贝斯虫病传播面积逐年增大[8]，该病没有特殊的临床症状，只是表现为精神沉郁、体温升高、黄疸、贫血等[4,10]。有的慢性感染甚至症状极不明显[11-12]，因此，该病从症状方面很难作出确诊，只能进行实验室诊断。马驽巴贝斯虫病的实验室诊断方法主要有血涂片法、免疫学诊断和分子生物学诊断方法，血涂片法是一个比较传统、有效的检测手段，但是该方法对于感染的虫体量较大时容易检出，对于体内虫体较少或慢性感染的病畜检出率都不高[4-11,13-14]，大批量检测时还需要大量的检测时间和专业的技术人员。免 疫学检测方法包括补体结合试验、间接荧光抗体试验和 酶联免疫结合试验,虽然后 两者是国际贸易的指定试验[2]，但这些方法也有着各自的缺点，如补体结合试验和间接荧光抗体试验对于慢性病畜的灵敏性低；酶联免疫结合试验易出现的假阳性结果[4,11,13-14]；感染初期，血清学手段无法检测到足够的抗体水平而出现的假阴性结果等[11]，这些问题都制约了检测的准确性。而聚合酶链式反应，因其直接检测病原体核酸而非抗体这一特性，有效的解决了上述方法的不足[16]，且该方法更适用于对进出口马匹的检测[4]。在国外，很多学者更愿意尝试血清学方法和分子生物学方法结合起来，共同诊断或检测马梨形虫病[11,17-19]。因此，根据实际工 作的需要， 本研究建立了马驽巴贝斯虫PCR检测方法，并且运用该方法做出了较为满意的试验结果。

本研究根据马驽巴贝斯虫Bc48特异性基因序列设计并合成了一对特异性引物和荧光探针，分别建立了马驽巴贝斯虫病PCR方法和qPCR检测方法。Bc48蛋白目前被认定为专门用于虫种鉴别上的特异性蛋白，该蛋白以及其特异性基因序列，广泛应用于E LISA方法和PCR方法虫种的鉴定[8-9,18,20-22]。经特异性试验表明，本文设计的引物只针对马驽巴贝斯虫体DNA扩增出大小为200 bp的产物，对其他虫种均无特异性产物。 在方法优化上，采用了均匀设计方法，筛选出最优的反应退火温度及时 间，最终确定退火温度为58℃，退火时间为1 min，因为上述两种方法共用一对引物，所以退火温度及时间相同。

在马驽巴贝斯虫的PCR检测方面，国内外学者也做了一些相关研究，早在1999年，Bashiruddin等[12]利用16S rRNA基因建立了马驽巴贝斯虫PCR检测方法，2005年，Alhassan等[23]利用Bc48基因建立了马驽巴贝斯虫PCR检测方法；在国内，有学者分别利用18S rRNA和Bc48基因建立了该病的PCR检测方法。这些 方法均有着良好的检测效果，但是大部分都是普通PCR检测，不仅检测周期长、操作复杂，灵敏度也和qPCR方法有着差别[20,24]。本文建立的PCR方法最低检出限为4.04×102copies/μL，qPCR方法最低检出限为4.04×101copies/μL，两种方法灵敏度差距10倍，在方法灵敏度方面接近张扬等[8]的研究结果。应用两种方法对33份样品检测可知，qPCR方法的检出率要显著高于普通PCR方法，且阳性样品用qPCR方法检出的Ct值均介于30～38之间，由此可知，阳性样品中病原是极微量的。对于PCR方法，最低检出限为4.04×102copies/μL，所对应Ct值为33.55，即Ct值大于33.55时，将超出PCR方法的最低检出限，该方法难以检出。因此，对于样品中极微量的病原检测时，qPCR方法更为敏感，且该方法不需要电泳检测，更适合对大批量样品的检测工作。

近几年来，马的进口数量急剧增多，为了促进地区间的马产业发展，建立一种准确、可靠、快速、经济的检测方法十分必要。本研究为后续建立马驽巴贝斯虫病数字PCR检测方法奠定了扎实的基础，不仅可以为检测提供重要的技术储备，同时也为其他同类病病原的快速检测提供借鉴和经验。