买占海，沙娅·奴尔兰,2，王德超，张敖云图雅，侯 宇，况 玲

（新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052；2.伊犁州动物疾病预防与控制中心，伊宁 835800）

马腺疫通常由马链球菌（Streptococcus equi,S.equi）马亚种感染，可引起马属动物的急性接触性传染病，典型病例的临诊特征为体温升高，上呼吸道咽黏膜呈卡他性或化脓性炎症，颌下淋巴结呈急性化脓性炎症，属于三类动物疫病[1]。S.equi为链球菌属C群成员。菌体呈椭圆形或球形，革兰氏染色阳性，无运动性，能够形成荚膜。S.equi的毒力因子包括透明质酸、链球菌溶血素S、IgG结合蛋白、致热外毒素、肽聚糖、抗 吞噬的类M蛋白和粘附因子纤粘蛋白结合蛋白[2]。细菌粘附素靶向纤粘蛋白（fibronectin,FN），是脊椎动物细胞外基质和血液中发现的主要糖蛋白[3]，其结合蛋白有3种：FNEB、FNE和SFS[4]，其中FNE和SFS为分泌型蛋白[5]，FNEB为细胞表面锚定型蛋白[6]，通过克隆序列分析发现FNEB是一个编码475残基Fn结合蛋白FNEB的基因，其具有革兰氏阳性细胞表面蛋白（N-末端信号序列，残基1-35）的典型特征和高度保守性，徐全圆等[2]已应用FNEB基因分离出马链球菌马亚种。

马腺疫疾病的临床快速诊断至关重要，能够准确诊断患病马匹并及时隔离，做好平时预防工作有助于防止马腺疫传播，可提高幼驹成活率减少经济损失。目前马腺疫的鉴定仍然依靠传统的临床手段，马腺疫病原菌马链球菌马亚种依旧用繁琐耗时的培养方法来分离鉴定，这也是导致马腺疫进一步传播的诱因[7]。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification assay,LAMP）是一种快速和高度特异性的基因扩增方法，该方法比PCR方法更快，使用仪器简单，更容易操作[8]。建立具有特异性高、敏感性好、便捷快速特点的fneB-LAMP检测方法，可为基层检测马腺疫疾病提供有效的诊疗手段。

1 材料与方法

1.1 样品来源 采集新疆昭苏县3个马场发现疑似患马腺疫的马匹样本，共采集样品40份，其中A马场采集14匹马的鼻拭子，编号A1-A14；B马场采集10匹马的鼻拭子，编号B1-B10；C马场采集14匹马的鼻拭子14份，以及2匹下颌淋巴结破溃的脓汁2份，共16份样品，编号C1-C16。

1.2 菌株来源 马链球菌马亚种N20和N25为新疆农业大学中兽医实验室保藏菌；蜡状芽孢杆菌和链球菌分离鉴定于本实验的马腺疫临床样本；金黄色葡萄球菌（9-14）、无乳链球菌（151102）、金黄色葡萄球菌（E3）和大肠埃希菌由新疆畜牧科学院提供。

表1 试验用菌株Table 1 Strains used in this study

1.3 主要试剂及仪器 LAMP反应试剂：Bst DNA聚合酶（8000 U/mL）、MgSO4（100 mmol/L）、10×ThermoPol反应缓冲液均购自纽英伦生物技术（北京）有限公司；dNTP Mixture（10 mmol/L）、甜菜碱购自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green Ⅰ核酸染料购自北京索莱宝科技有限公司。PCR反应试剂：2× Taq PCR Green Mix、ddH2O、DNA marker购自宝日医生物技术（北京）有限公司公司。常规试剂：快速革兰氏染色液、链球菌细菌生化编码鉴定管A203、pMD-19T、感受态细胞DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Omega公司。

1.4 LAMP方法建立

1.4.1 细菌DNA模板的制备 取1 mL菌液悬于1.5 mL离心管中，1110.79 ×g，离心1 min，弃上清液；用ddH2O洗涤菌体沉淀两次，用100 μLddH2O溶解沉淀；将菌悬液于沸水浴中煮沸10 min，12 000 ×g离心1 min，取上清液，-20℃保存备用。

1.4.2 引物设计与合成 用马链球菌马亚种4047全基因组中的fneB基因序列为靶序列，将靶序列在NCBI网站上进行比对分析，确定其保守序列。应用在线软件设计LAMP引物，引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表2。

表2 LAMP扩增引物序列Table 2 Primer sequences of LAMP reaction

1.4.3 LAMP反应初步体系 25 μL的初步反应体系为：10× Bst DNA Polymerase Buffer 2.5 μL，50 mmol/L MgSO44 μL，10 mmol/L dNTPs 3.75 μL，5 mol/L甜菜碱4 μL，8 U/μL Bst DNA polymerase 1 μL，5 μmol/L F3/B3 1 μL，20 μmol/L FIP/BIP 1.5 μL，20 μmol/L LF/LB 1 μL，DNA模板2 μL，加0.75 μL ddH2O至25 μL。

1.4.4 LAMP反应初步操作程序 取1 μL荧光染料SYBR Green Ⅰ置LAMP管中，水浴锅温度调至63℃反应60 min，放入80℃水浴锅中10 min终止反应。反应结束后稍作离心，肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀；将管盖的荧光染料甩入管中，在紫外灯下呈荧光绿色为阳性，呈橘黄色为阴性；再通过凝胶成像仪观察结果是否呈特征性梯形条带。

1.4.5 LAMP反应灵敏性检测 通过微量紫外分光光度仪OD260测定提取的S.equi菌株单菌落DNA模板浓度，通过阿伏加德罗常数（NA：6.02×1023/moL）得到拷贝数（copies）=（[阿伏伽德罗常数×质粒浓度（g/mL）]/质粒相对分子质量（g/moL）），用ddH2O将已知拷贝数的DNA模板用10倍法稀释，取稀释度在1.0×107～1.0×101copies/μL作为模板，PCR反应体系为25 μL：Taq聚合酶预混染料（2× Taq PCR Green Mix）12.5 μL，上、下游引物各1 μL，细菌DNA模板2 μL，ddH2O加至25 μL。反应条件为：95℃预变性，5 min；95℃变性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35个循环；72℃再延伸10 min，目的片段大小1428 bp。用25 μL初步反应体系的混合液，取扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳观察，通过凝胶成像仪分析敏感性。

1.4.6 LAMP反应特异性检测 取大肠埃希菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球、蜡状芽孢杆菌、克雷伯杆菌的DNA模板做对照，同时以ddH2O为阴性模板，一株S.equi菌株作为阳性模板对照，检测方法的特异性，通过电泳及凝胶成像分析仪检测该方法的特异性。

2 结果

2.1 初步LAMP可视化检测结果 两株S.equi菌株N20和N25，用表2中的LAMP引物建立初步25 μL体系fneB-LAMP，在紫外灯照射或肉眼观察下，结果阳性呈荧光绿色，阴性呈橘黄色（图1）；两株S.equi菌株凝胶成像扩增出特征性梯形目的条带（图2）。

图1 LAMP可视化检测结果Fig.1 LAMP visual detection

图2 S.equi菌株LAMP扩增结果Fig.2 LAMP amplification of S.equi

2.2 fneB-LAMP敏感性测试 通过微量紫外分光光度仪OD260测定提取的S.equi菌株单菌落DNA模板浓度为80 ng/μL，采用LAMP进行检测时，结果如图3所示，基因组浓度稀释倍数为10-4的模板仍可以扩增得到阶梯式的目标条带，可检测的灵敏度达8×10-6μg/μL，而采用常规PCR检测时仅检测出10-2和10-1的模板，比LAMP低了两个数量级。

图3 fneB-LAMP的敏感度实验Fig.3 The sensitivity of fneB-LAMP

2.3 fneB-LAMP特异性试验 对大肠杆菌、金黄色葡萄菌、无乳链球菌、从马腺疫临床样本中分离出的一株蜡状芽孢杆菌单菌落和一株链球菌5株菌，以及S.equi菌株N20和N25基因组DNA进行特异性试验。结果如图4所示，仅有S.equi菌株N20和N25基因组DNA出现阳性扩增条带，其余5株均未出现特征型梯形扩增条带，表明该引物具有良好的特异性。

图4 fneB-LAMP的特异性结果Fig.4 The specific results of fneB-LAMP

2.4 fneB-LAMP检测分离株结果 利用本实验建立的fneB-LAMP，检测出7株分离菌株，A13、C6、C2、C9、C14、A8、C16，通过PCR检测验证7株菌均为阳性，出现了特异性梯形条带，阴性对照未出现任何条带（图5），表明该方法能够成功检测出马腺疫S.equi。

图5 fneB-LAMP样品检出结果Fig.5 Sample detection results of fneB-LAMP

3 讨论

马腺疫是一种世界范围内常见的传染性很强的马的上呼吸道疾病，传染源是病畜和病愈后的带菌动物。接种疫苗、结合早期诊断和及时隔离治疗可以预防马腺疫。根据临诊表现结合流行病学可做出初步诊断，虽然典型腺疫的马匹临诊症状明显，但一过型腺疫和康复的马匹是重要传染源往往会被忽视，恶性型腺疫也可能会误判，并且早期诊断及确诊增多需进行实验室检查。马链球菌马亚种（Streptococcus equi subspecies equi）是马腺疫的主要病原体，细菌学检查是最可靠的方法。核酸检测技术应用日趋广泛，已有的热循环检测技术操作繁琐仪器昂贵，较难满足市场需求。现已有多种恒温检测技术，其中环介导等温扩增技术（LAMP）是一种简单、快速、特异性强的检测方法，扩增条件仅为恒温仪器，具有在基层应用的前景[9]。

该fneB-LAMP方法相对于其他核酸检测技术，选择样本核酸提取方法中，LAMP反应的耐受性很好，比普通PCR高很多，由于LAMP反应中的Bst DNA聚合酶具有很好的耐受性，样本中的异物对反应的影响比较小，因此LAMP扩增时却不一定需要纯化核酸样本，具有模板选择粗提的优点。常用的扩增仪器有恒温扩增检测仪和金属浴锅，恒温扩增检测仪可实现扩增过程的实时监测，有数学模型进行数据处理和图形绘制，可自动判读结果，本研究使用的恒温仪器是恒温水浴锅，经试验结果表明，水浴锅可用于恒温扩增目标DNA，有特异性、灵敏度比普通PCR高等优点，符合基层使用LAMP技术的设想，具有继续开发的前景。

本文的主要目的是探索LAMP方法用于马腺疫病原菌检测的可能性，S.equi是LAMP方法测定的主要病原体，其中已有针对seM基因的seM-LAMP检测方法[10]，本研究与该方法相比，优点是特异性强，检出率更高，通过敏感性检测，fneB-LAMP与常规PCR方法相比灵敏度高达2倍。报道的马链球菌胞外蛋白（fibronectin-binding protein,FNEB），含有保守的FN结合重复序列和细胞壁锚定基序，fneB基因作为S.equi的毒力因子之一，可用于扩增目的基因片段用LAMP方法检测马腺疫。该fneB-LAMP方法相对于其他核酸检测技术，具有模板选择粗提、特异性高、灵敏度比普通PCR高等优点。

马链球菌的检测会受多种因素的影响，包括样本收集部位（鼻侧通道、鼻咽与喉囊）、培养方式与检测方法、PCR靶基因的选择、DNA扩增方法[11-14]。本实验从伊犁地区3个马场采集的40份临床马腺疫样本，马匹为1岁以内幼驹，临床表现鼻粘膜卡他性炎症，流出黏液性或黄白色脓性分泌物，颌下淋巴结肿大可达鸡卵或拳头大小，充满下颌间隙。选用鼻腔深处鼻拭子，以及2匹淋巴结破溃马匹脓汁采样。

每年春秋季天气变化较大时幼驹患马腺疫的概率非常大，几乎每匹幼驹都有马腺疫史，依据自身免疫力及细菌毒力而表现不同程度症状[15]。马腺疫病原的实验室诊断通常是对鼻拭子、脓汁及鼻洗液等样品对细菌进行分离鉴定，利用PCR方法特异性检测到seM基因，也可用血清学方法鉴定马链球菌马亚种[16]。