刘 健，李凯航，鞠厚斌，李 鑫，葛菲菲，杨德全，杨显超，葛 杰，邓 波，周锦萍

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

禽白血病（avian leukosis,AL）是指由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽白血病病毒引起的以禽类造血组织中某些细胞成分过度增生为主的一类可传染的肿瘤性疾病，根据病原学和病理学的特点，可以将禽白血病分成四个型，即淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、成髓细胞性白血病和髓细胞性白血病[1-2]。根据在不同遗传型鸡胚成纤维细胞上的宿主范围、与相同或不同亚群成员的干扰模式以及用病毒血清中和试验鉴定的病毒囊膜抗原，禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）可分为A至K共11个亚群，其中A、B、C、D、J和K属于外源性白血病病毒，E、F、G、H和I属于内源性白血病病毒[3]。A、B、C、D、E、J和K亚群分离于鸡，A、B亚群在野外是常见的外源性病毒，很少有C和D亚群病毒在野外被发现的报道，E亚群包括极普通的内源性低致病力白血病病毒[4]。J亚群主要引起鸡的传染性致骨髓细胞瘤疾病或成髓性白血病[5]。K亚群禽白血病病毒是2012年王鑫等[6]首次从我国地方品种芦花鸡中分离到的新亚群。另外F亚群和G亚群也曾经被从环颈雉、黄金稚和Lady Amberst雉中分离到。H亚群分离自匈牙利鹧鸪，I亚群分离自冈比亚鹌鹑[7]。

本研究从七彩山鸡品系中检测到1株内源性禽白血病病毒，将其命名为PC1701，并进行了病毒的鉴定及其env基因序列分析。

1 材料与方法

1.1 试剂 禽白血病p27抗原检测试剂盒购自美国IDEXX公司；DMEM细胞培养液、胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、胰酶消化液（0.25%）购自GIBCO公司；DF1细胞由山东农业大学动物科技学院禽病研究室赠送。

1.2 样品采集及处理 使用肝素钠真空采血管无菌采集雌性山鸡血样品200份，完全混匀，24 h内（冷藏条件）送至实验室，2000 ×g离心2 min后冷藏备用。

1.3 病毒分离和传代 吸取样品上清液底部白细胞层100 µL接种到长有单层DF1细胞的24孔板中，37℃、5% CO2培养箱中吸附2 h，用含1%胎牛血清的细胞维持液换液后连续培养9 d。传代时将24孔板中的细胞消化传代，同时将细胞上清液也接种于新的DF1细胞中传代。

1.4 病毒鉴定

1.4.1 p27抗原的测定 按试剂盒说明书进行ALV p27抗原的检测。如果检测结果为阴性，则在DF1细胞上可盲传至第3代，若第3代盲传结果为阳性时，则继续盲传至第9代，若结果为阴性，则判定结果为阳性。

1.4.2 env基因扩增和测序 参考文献[8]合成引物（上游引物：5′-G ATGAGGCGAGCCCTC TCTTTG-3′；下游引物：5′-TGTGGTGGGAGGT AAAATGGCGT-3′）。扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃变性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸2 min，32个循环；72℃延伸10 min。1%凝胶电泳观察扩增产物，发现有2200 bp大小的片段时，即可将PCR产物送至测序公司进行测序。

1.5 测序结果与各亚群参考株的同源性比较 利用GenBank中的BLAST工具查找与已测序列同源性较高的毒株，并使用DNAStar软件，将本研究测得的序列分别与GenBank中已发表的不同亚群ALV序列作同源性比较，根据同源性及遗传进化树来确定该分离株的亚群类型。不同亚群ALV参考毒株的信息见表1。

表1 用于env基因比较的不同亚群ALV参考株Table 1 env gene sequence comparisons of different ALV subgroups reference strains

2 结果

2.1 p27抗原检测和传代结果 对200份血浆样品的第1代细胞上清液进行p27抗原测定，有13份细胞上清液为ALV p27抗原阳性，阳性率为6.5%。将第1代ALV p27抗原阳性的细胞裂解液和细胞上清液进行传代培养，其第2代细胞和上清液ALV p27抗原均为阴性。盲传至第9代，除第1代细胞上清液ALV p27抗原阳性外，其余代次ALV p27抗原均为阴性。

2.2 细胞上清液PCR结果 对ALV p27阳性的细胞上清液进行PCR检测，除第1代细胞上清液扩增出2200 bp大小的PCR产物外，其余代次均无2200 bp大小的PCR产物（图1）。

图1 env基因扩增产物Fig.1 PCR amplification of env gene

2.3 已测序列与各亚群参考株的同源性比较结果 对阳性的PCR结果进行测序，共测得2段均为1001 bp的片段，其中上游引物片段与已知序列同源性为39.1%～66.7%，下游引物片段为非目的片段或者随机片段，在GenBank中BLAST后与CLB908M（GenBank登录号：JX855935）和NX0101（GenBank登录号：DQ115805）同源性最高，分别为65.3%和66.7%（表2）。遗传进化树也表明分离株1701与其他亚群参考株同源性最低，不属于已知的A～E和G～K的任何亚群（图2）。

图2 分离株PC1701与其他ALV亚群参考株env基因遗传进化树关系Fig.2 Phylogenetic tree for env gene sequences of isolated strains PC1701 and ALV reference strains of different subgroups

表2 分离株env基因与其他ALV亚群参考株同源性比较Table 2 Sequence comparison of env gene between isolated strain and other ALV reference strains of different subgroups

3 讨论

迄今为至，已报道的ALV有11个亚群，按分离鉴定的先后分别定名为A～K，其中A～E及J、K七个亚群是从鸡分离到的，其余是从其他鸟类分离到的[1]。内源性病毒是正常鸡基因组中与外源性基因组十分相似的结构元件，一般不以病毒粒子的形式进行传播，只作为鸡基因组的一部分按孟德尔遗传规律进行代次间传递[9]。本研究从七彩山鸡的蛋清中检测到p27阳性，采集其血浆在DF1细胞上进行病毒分离，其第一代细胞培养液为p27阳性，进行细胞盲传后，其后代次的细胞培养液p27均为阴性。研究结果表明，七彩山鸡鸡群中存在内源性禽白血病病毒感染，其同源性与已公开的禽外源性和内源性白血病同源性都较低，不能在DF1细胞中正常的增殖和传代，能够在蛋清中产生p27抗原，由此我们推断其携带内源性禽白血病病毒。

将第1代细胞培养物进行env基因检测，电泳结果出现一条与目的条带大小一致的条带，测序后在GenBank中进行Blast，其序列与GenBank中已公开ALV-A～K序列同源性普遍较低，与J亚群的NX0101和CLB908M两株毒株同源性最高，分别为66.7%和65.3%，其中NX0101来源于国内的白羽肉鸡，CLB908M是俄罗斯分离株，与其他已公开的ALV病毒同源性仅为39.1%～59.4%，由于GenBank中没有F亚群全基因序列，且测序结果与已知序列不匹配，因此与F亚群的同源性未作分析。

我国部分地方鸡种中存在内源性ALV感染，容易干扰外源性禽白血病净化程序，本项目中七彩山鸡属于雉，其禽白血病的带毒情况鲜有报道，因此其禽白血病的感染和带毒状况并不清楚，不利于其禽白血病的净化[10-11]。研究过程中，在其蛋清和血浆中未分离到外源性ALV，说明其无外源性ALV，但是其内源性ALV在细胞内进行表型表达，造成ELISA检测结果阳性，这对外源性禽白血病的净化造成了严重的干扰。本研究通过对七彩山鸡原种场核心群进行禽白血病检测，证实了七彩山鸡体内存在内源性白血病病毒，对于七彩山鸡禽白血病的防控与净化有参考价值。