六氟双酚A 对斑马鱼肝脏细胞氧化应激的影响

2022-03-10洪煜宇杨慧山谭伟军

现代畜牧兽医 2022年1期

洪煜宇，杨慧山，谭伟军

（1.广东省清远市动物疫病预防控制中心，广东清远 511518；2.佛山科学技术学院，广东佛山 528000）

工业生产的原材料或终产品为日常生活提供许多便利，但也不可避免地产生了一些环境污染问题。六氟双酚A（BPAF）主要应用于制常见的塑料制品造聚碳酸酯塑料和环氧树脂，如食品包装、玩具、牙科材料、耐热耐高温的工业材料[1-2]。BPAF具有雌激素样活性，作为一种环境中的内分泌干扰物质（EEDs），已被证明能够引发动物以及人类的生殖发育毒性[3-4]。Caroline等[5]研究表明，BPAF可引起斑马鱼的雌激素样毒性，但其毒性机制尚无进一步深入探讨。因此，本研究以斑马鱼的肝脏细胞作为研究模型，探讨BPAF对斑马鱼的毒性机制，进一步为BPAF的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

主要试剂：六氟双酚A 购自美国sigma 公司；CCK-8试剂购自日本同仁化学研究所；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒，均购自中国南京建成生物工程研究所；逆转录试剂盒以及荧光定量试剂盒购自TaKaRa 公司；胎牛血清及DMEM/F12培养基购自Gibico公司。

主要仪器：二氧化碳细胞培养箱、微孔板酶标仪（Thermo fisher）；高速冷冻离心机（Eppendorf）；7500Fast实时荧光定量仪（ABI公司）。

1.2 试验材料

斑马鱼肝脏细胞系ZFL细胞（ATCC）购自国家斑马鱼资源中心。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 ZFL细胞毒性试验

取对数增长期的ZFL细胞，消化后按照8×103个/孔的ZFL 细胞接种在96 孔板中，以每孔100µL 的含10%胎牛血清DMEM/F12 培养基进行培养。28 ℃、5%CO2条件下培养约12～24 h，待细胞生长至对数生长期，设置不同浓度的BPAF 浓度（0、1、5、10、20、30、40、50µmol/L），以0 浓度组为对照组；每孔重复6 次，24 h 后按照空白培养基∶CCK-8 试剂为10∶1 的比例加入CCK-8，28 ℃、5%CO2培养约3～4 h，450 nm波长检测各组OD值。

1.3.2 ZFL细胞的氧化应激水平

将ZFL 细胞接种在100 mm 的培养皿中，待细胞生长至对数增长期，设置不同的BPAF 浓度（0、10、20、30µmol/L），以0 浓度组为对照组；每组设置3 个重复，处理24 h，胰酶收集各组细胞，通过超声仪破碎裂解细胞，于4 ℃冰上检测细胞的CAT、SOD、GSH-Px 活性以及MDA含量，并检测细胞内的蛋白浓度。

CAT、SOD、GSH-Px 活性以及MDA 含量的检测方法按照试剂盒说明书进行。

1.4 数据统计与分析

数据采用SPSS 22.0 软件进行t 检验及单因素方差（ANOVA）分析。结果以“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 BPAF对ZFL细胞活性的影响（见图1）

由图1 可知，与对照组相比，10、20、30、40、50µmol/L BPAF组细胞活性极显著下降（P＜0.01），且呈BPAF依赖性的浓度下降趋势。当BPAF的浓度为40µmol/L时，ZFL细胞活性下降了55.51%，接近半数致死量。因此，以下试验选择0、10、20、30µmol/L作为BPAF的研究浓度。

图1 BPAF对ZFL细胞活性的影响Fig.1 Effect of BPAF on ZFL cell viability

2.2 BPAF对ZFL细胞的MDA含量、GSH-Px活性的影响（见图2）

图2 BPAF对ZFL细胞的MDA含量、GSH-Px活性的影响Fig.2 Effect of BPAF on the content of MDA and activity of GSH-Px in ZFL cells

由图2（a）可知，与对照组相比，10µmol/L BPAF 组细胞MDA含量显著提高（P＜0.05），20、30µmol/L BPAF组细胞MDA 含量极显著提高（P＜0.01）。由图2（b）可知，与对照组相比，20、30µmol/L BPAF 组GSH-Px 活性极显著降低（P＜0.01）。

2.3 BPAF对ZFL细胞CAT、SOD活性的影响（见图3）

由图3（a）可知，与对照组相比，10、20、30 µmol/L BPAF 组细胞CAT 活性均极显著降低（P＜0.01）。由图3（b）可知，20、30 µmol/L BPAF 组细胞SOD活性极显著降低（P＜0.01）。

图3 BPAF对ZFL细胞CAT、SOD活性的影响Fig.3 Effect of BPAF on the activities of CAT and SOD in ZFL cells

3 讨论

双酚类化合物作为日常生活中经常接触的工业化合物，主要应用于合成环氧树脂以及聚碳酸酯等分子材料，已被证明是一类对人类及动物健康有影响的内分泌干扰物[6]。BPAF 作为BPA 中的新兴高分子材料，广泛应用于日常塑料制品中[7]。研究表明，BPAF可造成哺乳动物的生殖毒性以及肝毒性[1]。

氧化应激指细胞内的氧化水平及抗氧化水平失去平衡。Lei等[8]研究发现，BPAF可引起乳腺癌细胞MCF-7的活性氧水平上升，造成细胞内的氧化应激。MDA 是脂质过氧化物[9]，CAT 和SOD 是细胞内的一类抗氧化酶[10]，均可作为细胞内的抗氧化水平的标志物。GSH-Px作为细胞中合成的最丰富的低分子量硫醇化合物，可通过清除自由基保护细胞免受氧化损伤[11]。本试验中选择了具有显著毒性作用的BPAF 作为ZFL 细胞的研究浓度，以MDA 含量和GSH-Px活性分析ZFL细胞内的氧化应激水平，可知BPAF 引起了ZFL 细胞内的氧化应激。通过CAT 及SOD分析细胞内的抗氧化水平，发现ZFL细胞中的抗氧化水平下降，标志着氧化应激及抗氧化水平下降情况下，BPAF导致了ZFL细胞内的氧化损伤。