山羊传染性胸膜肺炎荧光定量PCR 检测方法的初步建立

2022-03-10赵文华李富祥杨仕标

现代畜牧兽医 2022年1期

赵文华，李富祥，杨仕标

（云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224）

山羊传染性胸膜肺炎（CCPP）是一种由山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）引起的高度接触性传染病，流行于亚非各国。在易感羊群中，CCPP 的发病率和病死率分别达100%、80%，可对山羊养殖业造成的巨大经济损失，被世界动物卫生组织（OIE）列为必须报告的疫病之一[1-3]。CCPP的典型病症为高热（41～43 ℃），感染羊群无年龄和性别差异，妊娠母羊易流产[4-5]；病理特征为肺间质及间叶水肿。流行地区的CCPP 诊断比较复杂，在临床病理上必须与其他相似的综合症状加以区分，如小反刍兽疫、巴氏杆菌病等[6-8]。临床准确诊断该病通常结合临床症状与实验室方法。常用的实验室方法包括分子生物学检测、病原学诊断和血清学诊断等[9-10]。其中，进行病原分离是确诊CCPP最为特异准确的方法，但Mccp对营养条件要求苛刻，难以体外进行分离培养，非专业实验室一般无法完成分离鉴定；免疫血清学检测方法存在非特异性、实验室仪器设备要求成本高和不易操作等缺点；病原核酸检测则可快速确诊该病。本研究为建立快速进行CCPP临床检测的分子生物学核酸检测方法，以期为后续相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

CCPP 疫苗菌株由哈尔滨兽医研究所辛九庆老师馈赠，巴氏杆菌细菌为本实验室自临床送检病料分离获得。

1.2 试剂与仪器

主要仪器：TaKaRa MiniBest Universal Genomic DNA Extraction kit、TaKaRa Ex Taq RR001A（大连宝生物工程有限公司）；GeneAmp PCR SYSTEM 9700 普通PCR 仪、ABI 7500 Fast 荧光定量PCR 仪、荧光定量PCR 反应管（ABI 公司）；Nanovue Plus微量分光光度仪（GE公司）。

主要试剂：Premix Ex TaqTM（Probe qPCR，RR390A）试剂盒、Goldview 核酸染色剂（大连宝生物工程有限公司）；琼脂糖、氯仿、异丙醇、无水乙醇等（分析纯，上海生工生物工程技术服务有限公司）。

1.3 引物及探针

根据参考文献[11]及相关GenBank 序列设计两对CCPP 普通PCR检测引物，荧光定量PCR检测所用引物及探针根据自测序列及相关GenBank序列设计合成，级别为HPLC级的Taqman探针及引物均由大连宝生物公司合成。采用无RNAase酶的PCR级水溶解合成的引物/探针干粉，制备100 mmol/L的引物/探针贮存浓度、20 mmol/L的引物工作浓度、10 mmol/L的探针工作浓度，-80 ℃贮存。普通PCR引物情况见表1，荧光定量PCR引物情况见表2。

表1 CCPP普通PCR检测引物Tab.1 Primers of routine PCR for detection of CCPP

表2 CCPP荧光定量PCR引物探针Tab.2 Probe and Primers of real-time PCR for detection of CCPP

1.4 试验方法

1.4.1 菌体基因组DNA提取

按照提取试剂盒说明书操作。收集1.0～5.0×109菌体细胞，12 000 r/min 离心2 min，弃上清；将180 µL Buffer GL、20 µL Proteinase K 和10 µL RNase A（10 g/L）加入沉淀，混匀，56 ℃温浴10 min；将上述样本移入吸附柱，12 000 r/min离心2 min，弃滤液后加入500µL Buffer WA，12 000 r/min 离心1 min，弃滤液；再加入700 µL Buffer WB，室温静置1 min，12 000 r/m 离心1 min，弃滤液，循环2 次。最后将吸附柱安置于一新离心管，将50µL Elution Buffer 加入吸附柱膜中央，室温静置3～5 min，12 000 r/min离心2 min 洗脱DNA，弃去吸附柱，收集有DNA 液体的离心管，-80 ℃贮存。

1.4.2 反应体系及反应程序

CCPP 普通PCR 反应液：10×ExTaq buffer 5.0 µL、TaKaRa Ex Taq 0.5 µL、dNTP Mixture 4.0 µL、Primer F 1.0µL、Primer R 1.0µL、DNA 1.0µL、H2O 37.5µL。

反应程序为：95℃4 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，循环34 次；72 ℃10 min。采用2%琼脂糖凝胶跑电泳，紫外成像仪检测扩增结果，拍照记录。

荧光定量PCR 反应液：Premix Ex Taq（Probe qPCR）10.0 µL、Primer 16S-tryF1 0.2 µL、Primer 16S-tryR1 0.2 µL、Probe CCPP 16S 0.4 µL、Rox II 0.2 µL、DNA 1.0µL、H2O 8.0µL。

实时荧光定量PCR反应程序为：95 ℃20 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40个循环。

1.4.3 CCPP 普通PCR 扩增片段的纯化回收、克隆及序列测定

胶回收扩增得到的CCPP16S 及arcD基因片段，克隆连接至pMD-18T Vector，挑取阳性克隆，对获得的阳性克隆进行序列测定和BLAST 分析，具体详细操作步骤参见相关的参考文献[12]和[13]。根据获得的基因序列合成荧光定量PCR引物及探针。

1.4.4 构建标准曲线及敏感性、重复性试验

以已构建的CCPP-16S 基因pMD-18T 载体质粒为标准品，采用Nanovue Plus 核酸快速检测仪测定并计算原始质粒的浓度，制备108～100copies/µL 共9 个稀释度的标准品，构建CCPP-16S标准曲线并检测敏感性、重复性。

1.4.5 特异性试验及临床样本检测

除对CCPP疫苗株、临床样本进行荧光定量检测外，还对临床上极易混淆的巴氏杆菌等进行鉴别检测，以验证探针及配套引物对的特异性。

2 结果与分析

2.1 CCPP普通PCR扩增片段的纯化回收、克隆及序列测定（见图1）

由图1可知，根据表1所设计的两对引物对CCPP疫苗株DNA 进行常规PCR 扩增，均有预期大小片段扩增出。将各预期片段胶回收、纯化，克隆连接至pMD-18T Vector获得阳性克隆，提取质粒进行序列测定和分析；所测序列经网上BLAST 比对，均为CCPP 相应基因片段的正确序列。根据所测序列设计合成位于16S 基因片段的一对引物和配套探针见表2。

图1 CCPP疫苗株两对引物普通PCR扩增结果Fig.1 Result of routine PCR of CCPP vaccine strain amplified with the two primer sets

2.2 CCPP-16S 荧光探针标准曲线的构建（见图2～图4、表3）

由图2 可知，在103～108copies/µL 浓度之间标准品质粒浓度的对数与Ct 值之间存在良好的线性关系，CCPP-16S 探针标准曲线的方程式表达为：Y=-3.323 058X+41.844 292，R2=0.998 517，扩增效率为99.95%。上述方程式中Y为Ct值，X为拷贝数的对数，R2为相关系数。

图2 CCPP-16S质粒标准品荧光定量PCR标准曲线Fig.2 Standard curve of CCPP-16S standard plasmids real-time PCR

由图3可知，以Ct值35为阳性样品临界值，则CCPP-16S 探针对样本的检测敏感性可低至102.06copies/µL。由图4可知，利用配套引物对进行普通PCR检测时检测敏感度仅为104copies/µL，较实时荧光定量法的敏感度低近100 倍。以优化的反应条件选取103、104、105、106、107copies/µL的标准模板分别连续扩增3次，结果显示，每个梯度的样本重复性均较好。

图3 CCPP-16S质粒标准品动力学扩增曲线Fig.3 Dynamic curve of CCPP-16S standard plasmids

图4 CCPP-16S普通PCR敏感性试验结果Fig.4 Sensibility test results of CCPP-16S routine PCR

由表3 可知，组内重复性试验变异系数均小于2.5%，说明该方法具有较好的重复性与稳定性。

表3 荧光定量PCR CCPP-16S质粒标准品的重复性试验结果Tab.3 Repeatability test results of real-time PCR for CCPP-16S standard plasmids

2.3 特异性检测及初步临床应用（见图5）

由图5 可知，本研究建立的CCPP-16S 荧光定量PCR方法仅对CCPP有特异性荧光信号检出，而阴性对照、巴氏杆菌均无荧光信号测出。

图5 CCPP-16S Taqman探针荧光定量PCR检测结果Fig.5 Results of CCPP-16S Taqman probe real-time PCR

3 讨论

随着技术进步，各种疫病的检测均需实现快速、高效，以便及时应对疫情、准确处置，将损失降至最低。CCPP的病死率极高，危害极其严重，临床诊断中易混淆的疫病也很多；目前，国内外对CCPP 的诊断主要依靠病原分离鉴定、血清学试验以及分子生物学技术[14-16]。对比3 类诊断方法可知，传统的分离鉴定方法因支原体生长速度慢且生长条件苛刻等特点，无法立即解决快速诊断的问题；而间接血凝试验、补体结合试验与竞争ELISA 等血清学试验，因敏感性或特异性较差等缺陷问题，亦无法作为诊断该病原的快检方法。分子生物学技术具有快速、准确、灵敏、特异等优点，尤其是新近发展起来的荧光定量PCR 诊断技术。实时荧光定量PCR 是一种飞速发展且广泛应用于各行各业的快速定性、定量的检测技术。相对传统的基于抗体而建立的血清学检测方法及普通PCR技术，实时荧光定量PCR技术具有更快速更灵敏的优势，可通过检测病原遗传物质“核酸”对疫病进行快速确诊，进而及时制定疫情处置措施制定相应的治疗方案。