黄曾艳， 彭春丽， 黄曼萍， 刘永源， 李春燕， 梁东辉△

(1.南方医科大学珠江医院， 广州 510280； 2.广州中医药大学第一附属医院， 广州 510405；3.茂名市人民医院，广东 茂名 525000)

易损斑块是指易于形成血栓或可发展为“罪犯病变”的动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)斑块，其进展和破裂导致的血小板聚集以及血栓形成是急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes, ACS)的主要病理学基础[1，2]。随着“生物-心理-社会医学”模式的发展，焦虑、抑郁等不良心理应激与ACS的关系越来越受到重视。最新1项对国内531位ACS患者的前瞻性纵向研究结果表明，ACS合并焦虑或抑郁的患者12个月内发生非致死性心肌梗死的风险增加了约2倍，再住院风险增加了约5倍[3]。为此，当前冠心病防治领域需要从心理健康角度深化对AS易损斑块的基础性研究，进一步阐明AS斑块易损性的影响因素。本研究通过高脂饮食联合慢性不可预知温和刺激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)方法构建肝郁型动脉粥样硬化小鼠模型，探讨中医肝郁病理状态与AS斑块易损性的相关性。本研究已通过南方医科大学珠江医院实验动物伦理委员会审查，伦理号LAEC-2017-053。

1 材料

1.1 动物

30只雄性ApoE-/-小鼠，SPF级具有相同遗传背景的野生型C57BL/6J小鼠10只，8周龄，体质量(22±1)g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验动物许可证号SCXK(苏)2011-0003。小鼠饲养环境为SPF级,室内温度约23 ℃，自然光照，50%湿度，饮水自由。

1.2 主要试剂及仪器

小鼠去甲肾上腺素(norepinephrine,NE，武汉华美生物工程有限公司，货号CSB-E07870 m)；小鼠超敏C反应蛋白(high sensitivity c-reactive protein,hs-CRP，美国Rapid Bio Lab公司，货号06120401)；酶联免疫试剂盒、总RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒 (南京诺唯赞生物科技有限公司，货号分别为RC101、R223-01、Q331-02)；苏木素-伊红染色液(上海化学试剂厂，货号M020)。

酶标仪(德国Thermo Scientific，型号MK3)；荧光倒置显微镜(日本Nikon，型号TS100-F)；荧光定量PCR仪(美国Thermofisher，型号Applied Biosystems 7500)；全自动生化分析仪(美国Abbott Laboratories，型号Aeroset)。

2 方法

2.1 分组

8周龄C57BL/6J小鼠10只作为空白对照组，同等周龄ApoE-/-小鼠30只，随机分为正常对照组、高脂组、肝郁组共3组各10只。基础饲料适应性喂养小鼠1周后开始实验。空白对照组、正常对照组给予普通饲料喂养，高脂组、肝郁组全程给予含脂肪21%、胆固醇0.15%的西方膳食饲料(北京科澳协力有限公司提供，Co60γ灭菌处理)喂养，不做其他干预；肝郁组加用CUMS方法干预12周，复制ApoE-/-小鼠中医肝郁型动脉粥样硬化小鼠模型。

2.2 肝郁型动脉粥样硬化小鼠模型的建立

在高脂饮食喂养的基础上，采用多重CUMS方法建立ApoE-/-小鼠中医肝郁型动脉粥样硬化模型[4]，CUMS方法中孤立后群居6 h、湿润环境6 h、快速灯光交换加白噪音2 h、倾斜鼠笼6 h、整晚照明12 h、夹尾15 min、禁水24 h、禁食24 h 8种方法随机安排，为避免小鼠因适应刺激而影响干预结果，不连续加入相同刺激[5]。

2.3 肝郁型动脉粥样硬化模型小鼠行为学评价

实验共包括4组小鼠，其中肝郁组小鼠给予CUMS刺激，非肝郁组指空白对照组、正常对照组、高脂组3组小鼠未给予CUMS刺激。实验第14周采用高架十字迷宫(elevated plus maze, EPM)实验比较小鼠开臂滞留时间占总时间百分比(open arm time, OAT)、开臂进入次数占总进臂次数百分比(open arm entries, OAE)来评价小鼠的焦虑水平[6]。采用旷场实验(open field test，OFT)检测小鼠自发活动和探索行为，记录小鼠单位时间内某一肢体越过的格子数(crossings, Crs)即水平得分，后肢站立次数(Rearings, Res)即垂直得分[7]。采用6 min强迫游泳实验(forced Swimming Test, FST)记录后4 min内小鼠的漂浮不动时间，作为绝望行为指标[8]。

2.4 取材

行为学实验结束后称取小鼠体质量，使用1%戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉各组小鼠，采用眼球取血法，无菌条件下用眼科弯镊迅速夹去小鼠眼球，抗凝管收集小鼠血液分离血浆备用。取血后冰上操作，解剖小鼠迅速打开胸腔和腹腔，取出新鲜肝脏洗净血液，装入EP管后立即入液氮中冷冻备用。精细眼科镊从主动脉弓处轻柔分离主动脉，4%多聚甲醛固定液固定备用。

2.5 主动脉病理损伤观察

取各组小鼠主动脉行病理学检查：固定、修剪、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烤片、脱蜡、染色，组织学切片中石蜡切片采用HE染色，冷冻切片采用油红“O”染色观察主动脉病理损伤程度，病理形态学分析选择AS斑块面积最大的切片。

2.6 血浆生化指标检测

采用自动生化分析仪检测各组小鼠血浆脂代谢指标包括总胆固醇(total cholesterol, TC )、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)含量，以及中性粒细胞总数(neutrophils，NEUT)。

2.7 血浆NE、hs-CRP检测

依照ELISA试剂盒说明书，进行标准品的稀释、加样、温育、配液、洗涤、加酶、温育、洗涤、显色、终止。取450 nm波长，测量各孔的吸光度值，创建相应的标准曲线检测样品浓度，测算小鼠血浆NE、hs-CRP表达水平。

2.8 荧光定量PCR检测肝脏CRP mRNA表达

Trizol试剂抽提小鼠肝脏总RNA，紫外分光光度计进行总RNA纯度和完整性检测，合成cDNA进行PCR循环，反应条件为：94 ℃ 5 min预变性，94 ℃ 50 s变性，58 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸，34个循环，72 ℃ 10 min继续延伸。小鼠肝脏CRP引物序列为F: AAGGATCAGGACCGGGGTAG,R: GGCGT TCAGTGGCTTCTTTG。内参采用鼠GADPH，引物序列为F: TGCACCACCAACTGCTTAG,R: GGATGCA GGGATGATGTTC。2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 行为学实验结果

EPM开臂活动：肝郁组小鼠OAT(10.55±1.43)显著低于(P<0.001)非肝郁组小鼠(18.14±3.57)(见图1A)；肝郁组小鼠OAE(16.79±3.52)显著低于(P<0.001)非肝郁组小鼠(33.83±4.79)(见图1A)。OFT实验：肝郁组小鼠水平得分(31.58±4.6)和垂直得分(13.61±2.45)显著低于(P<0.001)非肝郁组小鼠水平得分(67.99±13.01)和垂直得分(25.52±4.31)，(见图1B)。FST实验：肝郁组小鼠的不动时间(145.66±21.89)明显高于(P<0.001)非肝郁组小鼠(64.55±12.29)(见图1C)。

注：OAT.开臂滞留时间占总时间百分比；OAE.开臂进入次数占总进臂次数百分比；Crs代表水平得分；Res代表垂直得分。肝郁组，n=10；非肝郁组：空白对照组、正常对照组、高脂组，n=30；与非肝郁组比较：*** P<0.001图1 各组小鼠高架十字迷宫(EPM)、旷场实验(OFT)、强迫游泳实验(FST)结果比较

注：A. 空白对照组；B. 正常对照组；C.高脂组；D. 肝郁组图2 各组小鼠主动脉HE染色比较(×200, n=10)

3.2 主动脉病理形态结果

3.2.1 HE染色结果 空白对照组小鼠主动脉壁厚薄均匀，内皮完整清晰，内膜光滑，中膜及外膜未见异常，无AS病灶(图2A)；正常对照组主动脉AS病灶可见内膜下少数呈圆形或椭圆形，胞质内含有大量小空泡的泡沫细胞聚集(图2B)，高脂组和肝郁组均表现为不同程度的内膜增厚，斑块内膜表面遭到破坏，脂质池被增生的纤维帽覆盖，主动脉壁厚度不均一为AS最具特征性的病变，其中高脂组纤维粥样斑块处于稳定期，AS病灶纤维帽厚，而脂质池较小，属于稳定型AS斑块(图2C)，肝郁组AS病灶弹力纤维破坏，纤维帽较薄，大量呈针状空隙的胆固醇结晶形成，脂质池较大易于破裂，属于ApoE-/-小鼠AS易损斑块(图2D)[5,9]。

3.2.2 油红“O”染色结果 主动脉瓣硬化是AS的标志，冷冻切片油红“O”染色可通过检测含脂泡沫细胞及其组成的粥样斑块来判断主动脉瓣的粥样硬化程度。本研究对照组中小鼠主动脉瓣形态良好，每层结构较为清晰，且排列整齐(图3A)。其余3组小鼠均存在不同程度的AS病变，动脉粥样硬化区域脂质呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。正常对照组、高脂组、肝郁组以粥样斑块为主要表现，脂质成分丰富，大量泡沫细胞崩解，纤维及基质成分增加，斑块深部为大量坏死物质(图3B、图3C、图3D)，其中肝郁组小鼠AS斑块所占动脉管腔面积最大，大脂质池内包含较多的针状空隙胆固醇结晶，大坏死核，薄纤维帽，极易破裂等易损斑块特征最为明显(图3D)[9]。

注：A. 空白对照组；B. 正常对照组；C. 高脂组；D. 肝郁组图3 各组小鼠主动脉瓣油红“O”染色病理学改变比较(×200, n=10)

3.3 小鼠体质量及血脂代谢结果

图4示，与空白对照组比较，正常对照组、高脂组、肝郁组体质量、TC、TG和LDL-C含量升高，HDL-C含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与正常对照组比较，高脂组、肝郁组体质量、TC、TG和LDL-C含量升高，HDL-C含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与高脂组比较，肝郁组体质量、TC、TG和LDL-C含量升高，HDL-C含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：TC.总胆固醇；TG.甘油三酯；LDL-C.低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C.高密度脂蛋白胆固醇；与空白对照组比较：*P<0.05；与正常对照组比较：#P<0.05；与高脂组比较：&P<0.05图4 各组小鼠体质量与血脂代谢指标比较

3.4 小鼠血浆NE、炎症标志物表达结果

图5示，与空白对照组比较，正常对照组、高脂组、肝郁组小鼠血浆NE、hsCRP、NEUT、肝脏CRP mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与正常对照组比较，高脂组、肝郁组血浆NE、hsCRP、NEUT、肝脏CRP mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与高脂组比较，肝郁组血浆NE、hsCRP、NEUT，肝脏CRP mRNA表达水平含量升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：NE.去甲肾上腺素；hsCRP.超敏C反应蛋白；NEUT.中性粒细胞总数；CRP.C反应蛋白；与空白对照组比较：*P<0.05；与正常对照组比较：#P<0.05；与高脂组比较：&P<0.05图5 各组小鼠血浆NE(A)、hsCRP (B)、NEUT (C)、肝脏CRP mRNA(D)表达比较

4 讨论

冠心病患者由于疾病带来的心理压力和机体不适，常引发焦虑、抑郁等不良情绪，这与中医肝郁气滞证型互相契合。中医学认为，冠心病病位在心，但因五脏相关，与肝关系密切。肝与心经脉相连，在调畅人体情志方面相互为用，心主血脉，肝主疏泄，肝的疏泄功能正常则气机畅调，血脉通利；若肝失条达则气滞血瘀，血脉闭阻，形成“胸痹”“心痛”。长期的临床实践表明，不良情志刺激是ACS发生发展的重要原因，肝气郁结是斑块易损、破裂及病情发展和恶化的关键因素[5,10]。在临床上疏肝理气中药的运用和精神心理治疗对缓解ACS患者的症状、稳定病情、减少复发率和死亡率具有确切的疗效[10，11]。

目前肝郁证的造模方法有多种，如四氯化碳注射导致急慢性肝损伤法、慢性束缚法、饮食偏嗜即高脂饲料喂养法、醋酸喂食、夹尾激怒等方法单独或联合应用，但以上几种方法存在对肝细胞损害较大、刺激因子单一等缺点，与肝郁证的临床实际尚存在较大差异[12]。本研究在高脂饮食喂养的基础上，联合采用CUMS方法[13]，应激因子强度低,可持续时间长，与临床ACS患者长期遭受心理应激的过程相似[14]，与肝郁证形成的病因学一致[4]。研究结果表明，通过多重CUMS刺激方法，从心理干扰、环境改变等多方面造成小鼠抑郁、焦虑等不良情绪，CUMS刺激小鼠在新异环境中的自主、探究行为减少,小鼠表现出喜欢眯眼、贴边、嗜睡、皮肤毛发枯槁稀疏无光泽、行动迟缓等肝郁征象，从而成功复制了最符合中医“肝郁”证的病理机制及证候特征的AS小鼠模型[15]。

脂质代谢紊乱和炎症反应激活是AS稳定斑块向易损斑块转变的重要病理机制。现代中医将AS并发高脂血症的病理改变归咎于中医“痰浊”[16]，已基本达成共识。肝主疏泄可助脾运化，若肝失疏泄、气机不利则会导致“木横侮土”，脾胃损伤，运化功用失常则水谷不能化生精微，导致膏脂代谢紊乱，脂质囤积于体内引发高脂血症[5,17]。本研究中肝郁小鼠体质量、脂代谢指标TC、TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量降低，与主动脉病理HE染色、油红“O”染色AS严重程度相一致，表明肝郁型动脉粥样硬化小鼠存在严重的脂质代谢紊乱，这可能是引发AS斑块不稳定和破裂的重要原因。

心理应激可诱导炎症、增强血流动力学反应，从而成为触发AS易损斑块破裂的重要原因。研究表明，当人体处于高度紧张等心理应激状态时，血液内的炎症白细胞尤其是中性粒细胞、单核细胞会明显升高[18]。本研究发现，肝郁小鼠血浆NE、NEUT、hsCRP水平升高，肝脏CRP mRNA表达量升高,提示肝郁ApoE-/-小鼠肾上腺素兴奋性增高,炎症反应加重,与现代医学研究中焦虑、抑郁等不良心理应激诱导的下丘脑-垂体-肾上腺轴紊乱的观点一致[19]。

综上所述，本研究通过高脂喂养联合CUMS刺激方法构建了肝郁型动脉粥样硬化小鼠模型，证明肝郁型动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠存在更为严重的炎症和脂质代谢紊乱，炎症和脂质代谢的严重失衡加重了AS病变，进一步加速了易损斑块的形成。本研究通过探讨肝郁型动脉粥样硬化模型小鼠与易损斑块的相关性，为冠心病二级预防方案中“心理预防”的观点提供了实验依据，提示临床医生在实践工作中要重视冠心病患者合并精神心理问题的筛查，要针对肝郁病理状态进行综合治疗。但本研究仅对肝郁与AS易损斑块相关性做了初步研究，下一步将在此基础上继续探讨肝郁与AS易损斑块形成的分子机制，寻找AS易损斑块的潜在干预靶点，为中医药防治ACS提供新思路与干预方法。