孙明谦， 杨会珍， 彭 勍， 张 颖， 苗 兰， 胡 广， 于 峥， 范晓迪， 林 力△， 杜 松△

(1.中国中医科学院西苑医院， 北京 100091； 2.中国中医科学院中医基础理论研究所， 北京 100700)

高脂血症是体内脂类代谢紊乱导致血脂水平增高的一种疾病，可直接引起冠心病、心肌梗死和心脏猝死等。作为一种慢性代谢性疾病，高脂血症对人体的损害具有隐匿、逐渐、进行性和全身性特点，因此及时发现和治疗对于预防心血管疾病具有重要意义。降血脂药物很多但都有一定的副作用，中药复方具有多途径、多靶点的作用特点，且不良反应少、药物依赖性低，当前开展中药防治血脂异常成为研究热点。

代谢组学作为系统生物学的一个重要分支，是研究生物体在生理病理状态或外部刺激下所有代谢产物变化的学科。它主要关注的是代谢循环中小分子代谢物的变化，通过分析其变化过程和代谢途径，可以反映体内病理生理过程或外部刺激的代谢应答情况。代谢组学这种“整体-动态-综合-分析”的特点，不仅有助于阐释疾病的发病机制[1]，而且也为阐释中药复方的作用机制提供了新的思路[2]。目前已开展的中药复方治疗高脂血症代谢组学研究[3]，结果表明高脂血症的发病过程中出现了特定氨基酸的代谢失调[4]，而对于氨基酸代谢、酮体代谢、三羧酸循环和脂肪酸氧化等代谢途径的调节也被证实是中药治疗高脂血症的潜在机制[5]。

温胆汤作为经典的祛痰名方，由半夏、茯苓、枳实、竹茹、陈皮、生姜、大枣组成，具有理气化痰、和胃利胆之功效，主治痰热内蕴、脾胃失运之证，临床也被用于治疗冠心病、高脂血症等[6]。动物实验证明，温胆汤对于大鼠的脂质代谢具有调节作用[7]，但目前尚未见到基于代谢组学的相关研究。本实验拟应用代谢组学技术对温胆汤治疗高脂血症金黄地鼠的作用机制进行研究，挖掘其调节的生物标志物及相关代谢途径。本研究已通过中国中医科学院西苑医院动物伦理委员会审查，伦理号2019XLC016-2。

1 材料

1.1 动物

SPF级叙利亚雄性金黄地鼠，体质量90～110 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号SCXK(京)2016-0011。动物饲养于中国中医科学院西苑医院动物实验中心屏障环境设施中，标准颗粒饲料及洁净饮用水喂养，饲养环境为昼夜各半交替，温度18～22 ℃，通风良好，湿度恒定。

1.2 药品与试剂

温胆汤颗粒剂组成：清半夏、茯苓、枳实、竹茹、陈皮、生姜和大枣，购自北京康仁堂药业有限公司。主要试剂甲醇(货号164781)、乙腈(货号137738)色谱级，美国Fisher公司；甲酸(货号0J0921)，ROE SCIENTIFIC INC公司；测定试剂盒总甘油三酯(total triglycerides，TG，货号605517)、总胆固醇(total cholesterol，TC，货号701792)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C，货号701794)及 高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C，货号702824)，日本日立高新技术公司；高脂饲料(质量合格证号为11002900028290)，北京科奥协力饲料有限公司产品。

1.3 主要仪器

Q-Exactive Orbitrap四级杆-静电场轨道阱质谱仪，配有热喷雾离子源(HESI)、Xcalibur4.1化学工作站(美国ThermoScientific公司)，Vanquish超高效液相色谱系统，含二元梯度泵，自动进样器，柱温箱，DAD检测器(美国ThermoScientific公司)。MilliporeSynergyUV型超纯水机(美国Millipore公司)，SartoriousBT25 S型万分之一电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，VCX150PB超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司)，Micro 22R 台式高速冷冻离心机(德国 Hettich 公司)，LAbOSPEC T003日立全自动生化仪 (日本HITACHI公司)，BX51显微镜(日本 Olympus 公司)。

2 方法

2.1 模型制备与给药

动物适应饲养1周后，随机分为正常组12只、模型组11只和温胆汤组11只。模型组和温胆汤组大鼠饲喂高脂饲料8周建立高脂血症模型，从第5周开始温胆汤组灌胃温胆汤(给药剂量5.67 g/kg)，每天1次，连续4周给药。对照组实验期间饲喂正常饲料。

2.2 样品采集

实验结束取材时所有大鼠均禁食12 h，麻醉后腹主动脉取血，取上清待测血生化指标。各组大鼠取肝脏，部分组织固定用于 HE染色，其余组织-80 ℃储存备用。

2.3 血清生化指标检测

按试剂盒说明进行操作，通过全自动生化仪检测各组大鼠血清TG、TC、LDL-C及HDL-C水平。

2.4 HE染色

取各组金黄地鼠新鲜肝组织，10% 中性甲醛缓冲液固定过夜，常规石蜡包埋、切片、脱蜡，HE 染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察肝组织病理形态学变化。

2.5 代谢组学检测样品处理

冷冻肝脏标本室温下解冻，冰浴下在50%甲醇中以1∶10(w/v)的组织/溶液比进行均质(均质10 s后暂停10 s，重复均化2次直到获得均匀的匀浆)。精密吸取40 μL匀浆液，加入200 μL的冷有机溶液(乙腈∶甲醇=1∶1)，震荡混匀20 s，室温下放置10 min，在4 ℃下以16500×g离心力离心15 min，取上清液用LC-MS进行分析[8]。

2.6 液质条件

2.6.1 液相条件 采用Thermo Scientific的U3000快速液相色谱对样本进行分析。液相分离采用BEH Amide色谱柱(Waters公司，ACQUITY UPLC，1.7 μm，2.1×100 mm)，流动相A相为含0.1%甲酸的乙腈液，B相为含0.1%甲酸的水液，梯度洗脱(0 min为8%B，10～11 min为30%B，11～13 min为8%B)，14 min停止。两针之间平衡时间为1 min。流速0.3 mL/min，柱温35 ℃，样品室温度为4 ℃，进样量10 μL。

2.6.2 质谱条件 正、负离子检出模式，离子源温度350 ℃，喷雾电压3.5KV，S-LensRF电压60 V，毛细管温度300 ℃，鞘气和辅助气均为高纯氮气(纯度>99.99%)，鞘气流速：35arb，辅助气流速：10arb。数据采集采用一级全扫与数据依赖性二级质谱扫描ddMS2；分辨率70000(Full Scan)和17500(MS/MS)；碰撞模式为高能量碰撞解离。

2.7 数据处理

利用Xcalibur 2.1工作站进行数据处理，采用CompoundDiscoverer 2.0 软件对具有精确分子量的MS1和MS2质谱数据进行mz Cloud 谱图匹配、Chemspider、HMDB 以及Kegg Pathways等数据库搜索，参数为MS1质量精度<5ppm，谱库搜索算法为HighChem Low+High Res，打分匹配阈值> 60(越高匹配越准确，最高为100)，搜索过程中进行同位素匹配以及背景噪音扣除等处理。未被指认的代谢产物进一步进行Metlin等二级谱图搜库。本实验中质控(quality control，QC)样本由等量的不同样本混合制成，在LC-MS分析过程中，每进6个样本后进1个QC样本。为保证样品检测中的准确性，以实验中QC的变异系数(coefficient of variation，CV)值小于20%作为质谱检测到成分的筛选标准，大于20%的变量不纳入进一步分析。

将所得样品数据导入网络在线分析软件MetaBoanalyst 5.0，采用偏最小二乘法(partial least squaresdiscriminate analysis，PLS-DA)进行模式识别分析，通过PLS-DA的变量投影重要性(ariable importancein projection，VIP)值筛选变化显著的差异代谢物。

3 结果

3.1 各组金黄地鼠血脂水平

表1示，造模8周后与正常组比较，模型组血清LDL-C、TG 、TC 和HDL-C水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，说明高脂血症模型造模成功。温胆汤组 TC与LDL-C水平明显降低(P<0.05)。

表1 各组金黄地鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C水平比较

图1 各组金黄地鼠肝脏的HE染色图

3.2 各组金黄地鼠肝脏HE染色结果

图1示，正常组肝组织结构如常，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状分布，排列整齐有序，肝窦充盈可见，肝细胞未见肿胀变性，汇管区未见炎细胞浸润及纤维组织增生；模型组肝组织结构紊乱，肝细胞大片气球样变性，灶性小泡性脂肪变，肝细胞肥大致肝窦不明显，枯否细胞增生，肝小叶内可见炎细胞聚集灶，汇管区轻度炎细胞浸润及纤维组织增生。温胆汤组肝组织结构较正常，少量肝细胞气球样变性，变性程度及范围明显减轻，肝细胞肥大不明显，肝窦可见，散在肝小叶炎细胞灶，汇管区扩张，炎细胞浸润。

3.3 模式识别分析结果

为考察温胆汤对金黄地鼠血清样本代谢物谱的影响，将正常组、模型组和温胆汤组肝脏样本中的代谢物谱分别采用PLS-DA进行模式识别，得到三者的模式识别图。图2示，温胆汤给药组已与模型组呈现出明显的区别，并有向正常组恢复的趋势，说明温胆汤对高脂血症金黄地鼠具有良好的调节作用。

注：正离子(上左图)PLS-DA (A, R2Y = 0.9924，Q2= 0.85078)的模式识别图，负离子(上右图)PLS-DA (C, R2 =0.998， Q2= 0.877) 的模式识别图图2 正常组、模型组和温胆汤组金黄地鼠血清样本模式识别图

3.4 潜在生物标志物的发掘与鉴定

本实验主要发掘温胆汤发挥治疗高血脂作用的生物标志物。首先筛选高脂血症模型组和正常组区分较大的成分，即高脂血症肝脏中的潜在生物标志物。根据这些潜在生物标志物在给药组中含量的变化进行进一步筛选，发掘出给药组中浓度变化趋于正常组的代谢成分作为潜在生物标志物并进行下一步分析。具体鉴定过程中，利用Compound Discoverer2.0软件对化合物进行初步鉴定，得到3组金黄地鼠血液中所有化合物列表，然后利用PLS-DA分析，选出模型组与正常组差异大的离子进行初步鉴定和分析，筛选条件为VIP> 1，FC(Fold Change)>1.5，test p value (Student′s t )<0.05。进一步分析这些成分在正常组、模型组和温胆汤组中的变化，筛选模型组与温胆汤组具有显著性差异(P<0.05)，且均有向正常组水平恢复趋势的成分，即为温胆汤作用的潜在生物标志物[9]。表2图3示，通过将这些潜在生物标志物的二级质谱与网上数据库进行对比，鉴定出21种与温胆治疗作用相关的生物标志物和不同组别生物标志物强度。

表2 温胆方调节相关生物代谢成分比较

图3 温胆方调节内源性成分的变化趋势

4 讨论

温胆汤在临床上被广泛应用于治疗以“痰”为主要表现的诸多病证，其所治病证的核心病机为“气机郁结、痰浊内扰”且疗效确切。方中半夏降逆平胃气，陈皮理气燥湿，枳实行气破气消痰，茯苓健脾补脾，诸药合奏促使脾胃中焦气机恢复正常，从而达到调畅全身气机、理气化痰的作用[10]。“高脂血症”素来被认为与“痰”密切相关。

本研究发现，在高脂血症金黄地鼠中，蛋氨酸、半胱氨酸、L-焦谷氨酸3种与甲硫氨酸与半胱氨酸代谢途径相关的成分都出现异常，而温胆汤对这些成分均呈现出调节作用。在甲硫氨酸循环中，通过S-腺苷蛋氨酸介导生成同型半胱氨酸，同型半胱氨酸可进一步生成半胱氨酸，从而作为原料参与谷胱甘肽的合成。L-焦谷氨酸通过5氧脯氨酸酶代谢成谷氨酸，参与到谷胱甘肽代谢途径中[11]。谷胱甘肽是一种抗氧化剂，可以帮助机体清除自由基和过氧化物，从而维持生物体的相对稳定。该代谢途径的异常提示，高脂血症大鼠肝脏中氧化应激损伤的压力增加，而温胆汤可以通过调节这一代谢途径降低氧化应激损伤，发挥治疗作用。

模型组中嘌呤及嘧啶代谢相关的腺苷、腺嘌呤、1-甲基肌苷的成分含量都出现了明显的变化，腺苷和腺嘌呤都呈现出下降趋势，而温胆汤显示出回归正常组的调节作用，说明温胆汤可以对嘌呤代谢途径进行反馈调节。腺苷由腺嘌呤核糖核苷酸降解而成，可以进一步降解生成腺嘌呤，也可以在腺苷脱氨酶的作用下生成肌苷。肌苷可以甲基化生成1-甲基肌苷，或进一步生成次黄嘌呤和尿酸等[12]。腺苷、腺嘌呤这些代谢产物含量的变化，提示高脂饮食可导致体内嘌呤代谢途径异常，而温胆汤可以促使相关成分出现回调，稳定嘌呤代谢径，有利于缓解体内的代谢异常[13]。

研究结果显示，温胆汤可对高脂血症的精氨酸合成途径进行调节。精氨酸是一种必需的氨基酸，与心血管的生理病理过程密切相关。它是一氧化氮合成的底物，在维持正常血管功能，降低血小板活性和白细胞黏附方面发挥重要作用[14]。同时精氨酸参与尿素循环、多胺成分及肌酸的生成等一系列重要的生物代谢途径，这些途径都与心血管疾病有关[15，16]。在高脂血症状态下，精氨酸含量异常提示，一氧化氮合成及相关的代谢途径已经受到了干扰，这将进一步导致心血管疾病的发生与发展，而温胆汤可以对这一代谢途径进行调节，发挥治疗作用。由于精氨酸涉及的代谢途径较多，其具体机制仍需进一步研究。

磷脂酰胆碱代谢途径在金黄地鼠中出现异常，说明金黄地鼠的脂质代谢受到了干扰。甘油磷酸乙醇胺与甘油磷酸胆碱是磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺降解后的代谢产物[17]，其含量下降提示磷脂类成分整体代谢异常，下游代谢产物的下降提示前体的溶血磷脂类成分蓄积，而这些成分可能与炎症反应密切相关，是导致心血管疾病的重要因素。温胆汤对甘油磷酸乙醇胺与甘油磷酸胆碱具有显著的调节作用，说明温胆汤具有稳定脂质代谢途径的作用。研究还发现，温胆汤可对高脂血症金黄地鼠的淀粉与蔗糖代谢途径进行系统调节。模型组肝脏中核酮糖、葡糖酸盐、麦芽糖的含量都出现了明显的上升，能够导致肝脏中单糖和二糖类成分蓄积，温胆汤起到下调作用，显示其对糖代谢的不同环节均有一定的治疗作用。

综上所述，药效研究结果显示，温胆汤对高脂血症金黄地鼠具有一定的治疗作用。代谢组学研究发现，温胆汤给药组中21种内源性成分具有明显向正常组回调的趋势，提示其治疗作用可能与调节磷脂酰胆碱代谢、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、嘌呤代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸代谢等生物途径有关。