苏通 代培 丁雷 刘铜华 胡浩 胡燕 秦灵灵 周静鑫 王志程 郭翔宇

糖尿病现已成为继肿瘤、心脑血管病之后第三大严重威胁人类健康的慢性非传染性疾病[1]，国际糖尿病联盟(International Diabetes Federation, IDF)2019年发布的第九版糖尿病地图统计显示，目前全球约有4.63亿糖尿病患者，其中中国的成人糖尿病患者达到了1.164亿[2]。已有研究证实，microRNA与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的发生发展密切相关。microRNA是一类长约20～24 nt的非编码RNA，虽然不能直接编码蛋白，但可部分结合于靶基因mRNA的3’非翻译区从而抑制基因转录后的表达[3]，因此，研究中药对microRNA的调控机制是中药现代化研究的重点方向。中国民间常用的降糖中药番石榴叶(Folium Psidii Guajavae Psidium guajava L.)是桃金娘科植物番石榴的干燥枝叶，其单味药制剂“消渴降糖胶囊”被收录于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》第十五册，可治疗轻、中度糖尿病[4]。本实验通过基因芯片技术对番石榴叶提取物干预后的Zucker糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty,ZDF)大鼠胰腺组织进行检测分析，从分子水平上揭示番石榴叶对T2DM大鼠胰腺microRNA表达调控的影响，为发掘番石榴叶治疗T2DM的新靶点提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性自发T2DM模型ZDF大鼠12只、同周龄正常雄性Zucker瘦型(Zucker lean, ZL)大鼠6只，均购自北京维通利华实验技术有限公司，6周龄，体质量180～200 g，饲养于北京中医药大学SPF级动物实验室[动物许可证号：SYXK(京)2016-0038]。除每周检测空腹血糖前禁食12小时外，大鼠均自由进食、饮水及活动，12小时/12小时自然昼夜光线交替照射。

1.2 药物与试剂

番石榴叶药材原料购自四川医药集团(中国成都)，其乙醇提取物由北京中医药大学中药学院制备，提取过程如下：干药材分别加入12 BV和10 BV水提取两次，第一次提取1小时，第二次提取45分钟，合并滤液，减压浓缩至约1 g/mL的浓度，过滤，取上清液，直接过D101大孔树脂柱，用60%乙醇洗脱，减压浓缩，干燥，得到干燥粉末。血糖试纸及血糖仪均购自Bayer公司，血清胰岛素Elisa试剂盒购自Sigma公司，基因芯片检测由上海伯豪生物技术有限公司完成。

1.3 造模方法

所有大鼠适应性喂养1周后，ZDF大鼠使用高脂饲料诱导喂养，ZL大鼠使用普通饲料喂养。2周后以尾静脉采血法检测ZDF大鼠血糖两次，不同日随机血糖均≥11.1 mmol/L视为糖尿病模型造模成功。

1.4 分组与给药

将成模的ZDF大鼠按体质量随机分为模型组和治疗组，ZL大鼠作为正常组，每组各6只大鼠。根据人体给药剂量按照体表面积法折算为治疗组大鼠给药剂量，将番石榴叶提取物干燥粉末溶于蒸馏水中制成溶液，按0.01 mL/g体重每日灌胃给药(折合生药材8 g/kg)，模型组及正常组大鼠每日灌胃同体积蒸馏水，连续干预4周。

1.5 检测指标

1.5.1 一般情况 实验期间每天观察大鼠体型、毛色、活动量、精神状态等一般情况，每周检测并记录一次进食量及体重。

1.5.2 空腹血糖 每周检测并记录一次大鼠空腹血糖，采用快速血糖仪取大鼠尾静脉全血检测，检测前禁食不禁水12小时。

1.5.3 标本采集与检测 番石榴叶提取物给药干预4周后，将所有大鼠禁食不禁水12小时，称重，按40 mg/kg标准腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液麻醉，剖开腹腔，剥离腹主动脉，负压真空采血管进行取血，室温静置30分钟，4℃，3 500 r/min离心15分钟，抽取上清，用血清胰岛素Elisa试剂盒按制造商使用说明检测大鼠血清胰岛素水平。迅速剖取胰腺，置于冻存管中，保存在-80℃冰箱备用。

1.6 基因芯片检测

1.6.1 提取总RNA 采用miRNeasy Mini Kit(Qiagen公司)分别提取ZDF大鼠和ZL大鼠胰腺中的总RNA用于比对，并用RNase-free水将得到的RNA样品稀释至50 ng/μL。

1.6.2 样品去磷酸化 总RNA样品100 ng，10×CIP碱性磷酸酶缓冲液0.4 μL，标记外标RNA 1.1 μL，CIP碱性磷酸酶0.5 μL，共计4 μL，置于PCR仪中37℃恒温孵育30分钟以去除RNA5’端磷酸基团。

1.6.3 样品变性和标记反应 在得到的混合液中加入2.8 μL DMSO，并置于100℃金属浴中加热5分钟，然后迅速转入冰水浴中冷却，然后加入10×T4 RNA连接酶缓冲液1 μL、T4 RNA连接酶0.5 μL、Cyanine3-pCp荧光染料3 μL低速离心混匀，共11.3 μL，于PCR仪中16℃孵育2小时，荧光染料在T4 RNA连接酶作用下连接至RNA3’端，然后将样品置于50℃真空浓缩仪中完全抽干。

1.6.4 样品杂交 将抽干的样品重新溶解于17 μL nuclease-free水中，加入1 μL杂交外标RNA、4.5 μL 10×基因表达封闭剂、22.5 μL 2×Hi-RPM杂交缓冲液，置于100℃金属浴中加热5分钟，然后迅速转入冰水浴中冷却5分钟，反应液共计45 μL，用移液器将反应液缓慢吸至盖片上，按照说明安装芯片，置于杂交炉中，温度55℃、转速20 r/min杂交20小时。

1.6.5 芯片洗涤和扫描 杂交结束后，小心地将芯片分别放入含有Triton X-102的基因表达洗涤缓冲液的玻璃染色缸中，置于磁力搅拌器上，于室温下洗涤两次、37℃洗涤一次，每次5分钟，然后用吸水纸拭去芯片上的液体，放入扫描仪中进行扫描，提取杂交数据。

1.7 GO及KEGG富集分析

对治疗组大鼠胰腺中表达差异最显著的microRNA进行GO和KEGG富集分析，方法如下：采取 fisher 精确检验，数据包为clusterProfiler，来自R/bioconductor；挑选标准如下：落在某个term/GO上差异的基因数目≥2且p_value <0.05，画图中取得term/GO按照enrich factor的值从大小降序排列，取前 30 个结果。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 番石榴叶提取物对ZDF大鼠体质量的影响

与正常组相比，模型组ZDF大鼠体质量显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，治疗组ZDF大鼠体质量有降低趋势，但差异无统计学意义。见表1。

2.2 番石榴叶提取物对ZDF大鼠空腹血糖的影响

与正常组相比，模型组及治疗组大鼠空腹血糖显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，治疗组在给药第1周、第2周时空腹血糖无差异，第3周和第4周空腹血糖均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 番石榴叶提取物对ZDF大鼠胰岛素的影响

与正常组相比，模型组ZDF大鼠血浆胰岛素水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，治疗组大鼠胰岛素水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表1 番石榴叶提取物对ZDF大鼠体质量的影响

表2 番石榴叶提取物对ZDF大鼠空腹血糖的影响

注：红点代表上调表达的差异 microRNA，蓝点代表下调表达的差异 microRNA。

表3 番石榴叶提取物对ZDF大鼠血浆胰岛素的影响

2.4 番石榴叶提取物对ZDF大鼠胰腺组织microRNA表达水平的影响

2.4.1 治疗组与模型组胰腺中存在差异表达的microRNA。见图1。

2.4.2 模型组与治疗组胰腺中差异microRNA表达水平 与模型组相比，治疗组胰腺组织中共检测到9种差异表达的microRNA，差异有统计学意义(P<0.05)，包括 7种表达上调和2种表达下调，其中以miR-361-5p的表达上调最为显著(P<0.05且倍数变化≥1.40)。见表4。

2.4.3 GO富集分析 miR-361-5p的靶基因功能集中在结合磷蛋白和单羧酸跨膜转运方面，参与的生物学过程主要包括微管细胞骨架组织的构建过程、神经元细胞凋亡的负调节过程和间脑发育过程。见图2。

表4 模型组与治疗组胰腺中差异microRNA表达水平

注：圆形代表生物学过程，三角形代表细胞组分，正方形代表分子功能，面积越大代表富集程度越高，颜色越深代表差异性越显著。

2.4.4 KEGG富集分析 miR-361-5p的靶基因涉及的生物学代谢信号通路除了与肿瘤发生通路相关外，也与青年人中的成年发病型糖尿病和果糖、甘露糖代谢通路有密切关联。见图3。

3 讨论

超重和肥胖是影响中国T2DM患者发病的重要因素[1]，早在《素问·奇病论篇》中就有指出：“此五气之溢也，名曰脾瘅……此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴。”现代T2DM的治疗，应该“治之以兰，除陈气也”。“兰”可引申为具有芳香醒脾、化浊降脂功效的草药[5]，张锡纯曾言：“脾虚致渴，治渴当先实脾”。过食肥甘厚味易伤脾胃，致运化失司、痰湿内生，湿性重浊粘滞，若不加以利湿化浊，只是盲目滋阴，则病情反复，难以好转[6]。

注：圆形代表生物学代谢途径，面积越大代表富集程度越高，颜色越深代表差异性越显著。

番石榴叶有祛湿健脾、清热解毒的功效，最早记载于《南宁市药物志》：“收敛止泻。治泄泻，久痢，湿疹，创伤出血”，《台湾药用植物志》指出：“主治糖尿病”。现代药理学研究表明，番石榴叶降糖有效成分为三萜、黄酮类等化合物[7-8]，本课题组前期研究也证实，番石榴叶提取物分别通过多种胰岛素敏感的信号通路调控肝脏[9]、骨骼肌[10]、脂肪组织[11]中代谢通路的相关蛋白，进而促进体重和血糖的下降。然而作为一类调控机制更为复杂的非编码RNA，microRNA与番石榴叶提取物的关联性及其在胰腺中发挥的作用仍然有待研究。

microRNA是糖尿病研究最直观、准确的研究切入点之一，2004年Mattew等人[12]率先报道了在胰岛中发现的miR-375，并证明其影响了胰岛素的分泌，揭开了T2DM胰岛β细胞与microRNA相关性研究的序幕。目前，检测药物干预后microRNA的表达变化已成为发掘新型药物靶点的重要途径。本实验采用基因芯片技术筛查ZDF大鼠在番石榴叶提取物干预前后胰腺中microRNA的差异性表达，并成功检测出了9种差异性表达microRNA，其中miR-361-5p的表达上调最为显著。在Wang等人的研究中发现，miR-361-5p可竞争性结合特定的编码RNA，并作为一种拮抗剂抑制下游叉头框(forkhead box,Fox)转录因子O亚族1(FoxO1)的表达，从而抑制软骨细胞的凋亡[13]，提示miR-361-5p对FoxO1的调控可能是其作用机制的关键环节。

FoxO1是细胞内重要的转录因子，参与了糖脂代谢、氧化应激等重要的生物过程[14]。在胰腺中，它的低表达诱导了胰岛β细胞的去分化，导致胰岛素合成和分泌功能的丢失[15]。本实验结果显示，与模型组相比，治疗组大鼠不仅血糖降低，空腹血清胰岛素水平也显著下降，且体重也有降低趋势，说明番石榴叶提取物中的有效成在解除ZDF大鼠高糖毒性的同时还改善了胰岛素抵抗。基于对miR-361-5p调节FoxO1的认识，课题组推测miR-361-5p/FoxO1轴可能也存在于胰岛β细胞中，番石榴叶可能通过上调miR-361-5p的表达抑制胰岛β细胞中FoxO1的表达，使胰岛β细胞发生去分化，去分化可以避免胰岛β细胞因过度代偿而直接凋亡，使它们在应激条件下仍然能够保持再度分化的潜力。当番石榴叶提取物解除了高糖毒性和胰岛素抵抗之后，去分化的ZDF大鼠胰岛β细胞将再度分化成熟，以此更大限度地保留胰岛β细胞的功能。

综上所述，番石榴叶提取物可能通过调控miR-361-5p介入FoxO1诱导的胰岛β细胞去分化过程，从而保护了β细胞功能。本实验结果进一步丰富了番石榴叶的降糖作用靶点，为阐释清热祛湿类中药降低血糖的分子机制提供了新的思路。