姜良珍，王 罗，杨 涛，郑浩楠，赵江林，向达兵，邹 亮，万 燕,

（1.成都大学食品与生物工程学院， 四川成都 610106；2.农业农村部杂粮加工重点实验室，四川成都 610106；3.中国科学院成都生物研究所环境治理与食品安全领域， 四川成都 610041）

茯砖茶是以黑毛茶为原料，经过汽蒸、渥堆、发花、干燥等一系列复杂工艺制作而成的后发酵茶，其中发花是茯砖茶加工的关键步骤，决定着茶的品质。发花阶段，优势“金花菌”大量繁殖，茶叶在微生物作用下发生深度的生理生化变化，形成茯砖茶独特的风味[1-5]。通过形态学种群分析，DNA条形码和多位点测序等方法分析“金花菌”的进化关系，发现“金花”实际是冠突散囊菌的金黄色闭囊壳（图1），而冠突散囊菌是茯砖茶的唯一优势真菌[5]。在国家标准中，茯砖茶是唯一要求冠突散囊菌这项指标的黑茶类品种[6]。六堡茶等黑茶中也分离出冠突散囊菌[7]。本文主要讨论黑茶冠突散囊菌的生物学特性、酶系、代谢产物和安全性等特性，以及其发酵应用的研究进展。

图1 冠突散囊菌的菌落形态和显微特征[10]Fig.1 Colonial morphology and microscopic characteristics of Eurotium cristatum[10]

1 冠突散囊菌的生物学特性

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）属子囊菌纲，曲霉目，曲霉科，作为产有性型和无性型的全型真菌，其典型特征是具冠状突起及表面明显粗糙具小疣的子囊孢子和具小刺的分生孢子。根据其孢子的特征，将该菌有性型鉴定为冠突散囊菌（Eurotium cristatum），无性型鉴定为针刺曲霉菌（Aspergillus spiculosusBlaster），别名为冠突曲霉菌（Aspergillus cristatumBlaster）[8-9]。

冠突散囊菌好氧，耐干燥，最适pH为5，最适生长温度为28～30 ℃。该菌适应性较强，在茶砖和低渗培养基（0.5 mol/L NaCl）上行有性繁殖，繁殖方式随渗透压升高逐渐转变为无性繁殖，高渗透压（≥3 mol/L NaCl）条件下仅行无性繁殖[10]，其孢子在85 ℃冲泡5 min后仍可存活[11]。Ca2+信号途径及VeA基因在其适应高渗环境[12]和孢子形成[13]中发挥重要作用。碳源和氮源显著影响菌丝生长和产孢过程[14-16]，其中碳源为产孢所必需[14]。不同来源菌株对不同种类碳源的利用程度不同。固态发酵以D-果糖、葡萄糖、蔗糖、D-木糖、麦芽糖等为佳，而对山梨醇、琼脂、单宁和淀粉等利用较差；液态发酵对碳源种类依赖性较低[14-16]。碳源浓度[15]和氮源种类[16]亦影响产孢的类型和数量。无机氮源促进孢子萌发效果较好，而有机氮源对菌落生长的促进作用较大[16]，因此，在实际培养中往往采取两者结合的方式。

2 冠突散囊菌的酶系

冠突散囊菌能分泌多种胞外酶，如纤维素酶、蛋白酶和多酚氧化酶等。在茯砖茶“发花”过程中，冠突散囊菌通过分泌胞外酶促使茶叶中的茶多酚发生氧化、缩合，形成茶黄素、茶红素、茶褐素等物质，淀粉和纤维素等不溶性多糖分解转化为葡萄糖和果糖，蛋白质分解为氨基酸等，且使氨基酸、糖类、咖啡碱等各成分之间发生聚合、缩合等一系列的复杂反应[2,4,17]，消除茶叶的粗青、苦涩味，使茶叶在口味上更加醇和爽口，甜滑回甘，汤颜色红亮，形成茯砖茶特定的风味、香气、色泽，并且增加茶叶中的活性物质。纤维素酶在茯砖茶渥堆过程中能软化老叶，降解粗纤维为可溶性糖。高温杀青使茶叶中内源纤维素酶活性被急剧钝化，渥堆和“发花”过程中微生物的代谢活动使纤维素酶活性明显增强[18]。阿魏酸酯酶和木聚糖酶协同作用于晒青毛茶可显著提高其阿魏酸和低聚木糖的含量，增加茶汤活性物质[19]。胞外多酚氧化酶、漆酶等可将儿茶素氧化为茶黄素、茶红素和茶褐素等水溶性的色素[17,20-22]。过氧化物酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶和总超氧化物歧化酶是冠突散囊菌发酵茶抗氧化的物质基础[23]。其淀粉酶和蛋白酶等消化酶，可显著提高人体肠道中蛋白酶、淀粉酶的活性[24-25]，与茯砖茶的促消化作用密不可分。糖苷酶可将西洋参、高丽参的其他皂苷成分有效转化为人参皂苷Rd及多种未知结构的高保留性的皂苷产物[26]。酶是冠突散囊菌进行发酵应用的重要基础，其性质尚需进行深度研究。

3 冠突散囊菌的代谢产物

3.1 色素

冠突散囊菌在马铃薯等培养基上生长代谢通常会产生大量的色素物质，主要为黄色素和黑色素[27]。黄色素的含量与有性孢子数量正相关，与“金花”的颜色有关[27]。以石油醚提取陕西茯砖茶冠突散囊菌液态发酵的黄色素，发现其为脂溶性色素，最大吸收波长为398 nm，不耐高温，耐酸不耐碱，金属离子（Fe3+、Fe2+、Cu2+）、太阳光等条件会使其降解[28]。光谱学分析推测黄色素含有-C-H、C-O、C=C等官能团[28-29]。黑色素是一类结构复杂多样的酚类或吲哚类生物大分子色素的总称，具有避免光伤害、强抗氧化性、抗辐射、免疫调节等作用。冠突散囊菌所产胞外黑色素的最大吸收波长298 nm，在70 ℃以下耐热性强，Mg2+、Zn2+、Fe3+对其的稳定性有增强作用，遇光、氧化还原剂易分解[30-31]。冠突散囊菌色素的理化性质研究尚有待深入。

3.2 生物活性代谢物

冠突散囊菌含有多种生物活性代谢物，如黄酮、生物碱、哌嗪二酮衍生物和多糖[32-33]等。在脂多糖诱导的RAW264.7炎症细胞模型中，苯甲醛衍生物通过抑制iNOS和COX-2的表达发挥抗炎作用[34]。水溶性二酮哌嗪二聚体生物碱eurocristatine在糖尿病老鼠模型中可通过调节PI3K/AKT信号通路达到与二甲双胍相当的降糖效果[32-33]。脂溶性组分包含异戊烯基吲哚二酮哌嗪生物碱cristatumin F以及echinulin、dehydroechinulin、 neoechinulin A和variecolorin O，其中cristatumin F有DPPH自由基清除活性和对3T3L1细胞的边缘衰减作用[35]。真菌多糖是冠突散囊菌的重要的活性代谢物。菌株MK346334的粗糖提取液，尤其是EPS2组分，显示出与肠道微生物群调节相关的免疫调节活性[36]。从菌丝体分离的多糖ECIP-1A，分子量为24.3 kD，主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖等单糖组成，体外对巨噬细胞RAW264.7有显著的免疫调节活性[37]。发酵初期的冠突散囊菌菌丝能产生较高含量的洛伐他汀（降胆固醇药物）[14,38]。混菌共培养可拓宽真菌次级代谢产物谱，冠突散囊菌与金黄色葡萄球菌固体混合发酵产生两种新化合物（tetrahydroauroglaucine和epiheveadride），其混合代谢物对A549细胞等有较好的细胞毒活性[39]。

4 冠突散囊菌的安全性

冠突散囊菌曾被认为是有毒真菌。但急性毒理学试验显示，大鼠经口灌胃对冠突散囊菌的最大耐受剂量大于7.31×1010个/mL，对其发酵成的茯砖茶的LD50大于5001 mg/kg。喂养30 d后，各剂量组菌液和茶叶浸出液对大鼠在体重、血液学指标、脏器系数及一般行为方面均无显著性影响[11,40]。Ge等[10]通过系统分析比较转录组学和基因组学的数据发现冠突散囊菌不含毒素生物合成相关的基因簇。进一步检测常见的6种毒素发现，其仅产生低剂量的伏马菌素B1（0.17 ppm），远低于美国食品与药品监督总局食品安全国家标准的限量（2 ppm），而我国对此毒素尚无限量标准。以冠突散囊菌（CB10001）或其孢子饲喂高脂饮食的C57BL/6J小鼠，发现该菌可在小鼠肠道存活（超过2周时间），并可有效阻止小鼠增重，缓解炎症，调节肠道菌群，恢复肠道稳态[11]。冠突散囊菌可通过抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活来抑制结肠炎症反应，保护肠道屏障，从而改善溃疡性结肠炎小鼠的结肠缩短、体质量下降和评定疾病活动指数评分等指标，修复葡萄糖硫酸钠造成的病理组织学损害[41]。另外，茯砖茶在我国西北地区有悠久的饮用历史，研究显示其具有降脂减肥、增强免疫、调节糖代谢和调节肠道菌群等多种生物学功效[11,42-45]。因此，判定冠突散囊菌为实际无毒物，且为潜在的益生菌，为其推广应用提供了依据。

5 冠突散囊菌的发酵应用

5.1 茶叶加工

茶叶加工过程中人工接种冠突散囊菌可促进茶品质转化，加速发酵进程，缩短生产周期，利于全程清洁化生产，保证品质均一性。发酵过程以固态发酵为主，又可分为普通茶发酵和植物代茶发酵两种。多数茶叶经冠突散囊菌发酵后，苦涩味降低，散发独特菌花香，茶褐素增多，口感和品质得到提升。茶叶所含的化合物——香味物质、呈味物质、色泽和生物活性物质等均发生显著变化，进一步影响了茶叶的感官性状和功能活性（表1）。

表1 不同品种茶在冠突散囊菌发酵前后性状对比Table 1 Comparison of characteristics of different tea varieties before/after fermentation by Eurotium cristatum

5.1.1 气味物质变化 经冠突散囊菌适度发酵的茶叶，风味差异明显，香气物质含量与种类均有所增加，香气协调，兼具茶香和菌花香[17,46-48]。发酵可促进萜醇类物质的代谢，尤其是芳樟醇氧化物的含量显著增加。发酵茶汤所含的醛类气体减低，而酯类气体含量显著提高[17,46-48]。研究显示，在以茶叶的碳水化合物为碳源时，冠突散囊菌一方面通过MEP途径分解糖苷前体提供能量，产生大量的游离芳香化合物[47]；另一方面积累了大量的苯丙酸/苯环类化合物途径的中间代谢物，包括苯甲醇和苯乙醇，以及大量的甲酯化合物，如水杨酸甲酯、苯甲酸甲酯和苯乙酸甲酯[48]。这些化合物共同作用产生了特有的茶香和花香味。

5.1.2 呈味物质变化 冠突散囊菌发酵的茶汤，滋味甘甜醇厚。茶叶中负责不同口感的各种氨基酸含量显著减低，可能与美拉德反应和菌的生长代谢相关[17]。研究表明，冠突散囊菌发酵后的茶叶中总酚，尤其是茶叶苦涩味形成的关键化合物儿茶素类含量显著下降[17,46,48-49]。其中，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和表儿茶素（EC）等茶多酚含量下降最为显著[17,46]。酯型儿茶素水解能产生非酯型儿茶素和没食子酸（GA）[17,48]。EC、GA和EGC的含量随着菌代谢进一步降低[17]。另外，在影响茶叶苦味的生物碱（茶碱、咖啡碱、可可碱等）中，主要是咖啡碱的含量显著下降[17]。

5.1.3 色泽变化 冠突散囊菌“发花”过程对茶汤颜色影响显著，多数随着发酵程度的加深，茶叶颜色变深。茶黄素、茶红素等的含量先增加后减少，而茶褐素大幅增多[17,46-48]。过氧化物酶和漆酶能持续转化茶多酚成茶红素、茶黄素，而茶黄素、茶红素能与儿茶素以及其他化合物进一步通过聚合、缩合、偶联和氧化等作用形成茶褐素[17,46]。通过分泌多种胞外酶可促进了茶褐素的形成。茶褐素生物学活性较高，其含量的增加使茶汤颜色呈现棕红色，且可能是发酵茶主要的呈味物质[17,46]。另外，冠突散囊菌自身产生的黄色素、黑色素等色素，是否也对茶叶、茶汤的颜色产生了影响，目前尚无定论。

5.1.4 其他物质变化 由于纤维素酶、淀粉酶等酶的活性以及发酵环境的差异，冠突散囊菌发酵对茶叶可溶性糖含量的影响不尽一致。桑叶茯茶、杜仲茯茶和MF800948发酵的秋季绿茶的水溶性碳水化合物皆降低[17,50-52]，而“金花藤茶”的可溶性糖含量增加[53]。“金花”普洱[48]和“金花”甜茶[54]的总黄酮含量提高，而藤茶拼配红茶发酵制作的“金花藤茶”多酚、二氢杨梅素的含量显著减少[53]。

5.1.5 生物活性变化 茶叶内含物的变化影响发酵茶的生物学活性[55]。“金花”普洱总抗氧化活性和自由基清除能力皆提升[48]，冠突散囊菌发酵的甜茶[54]和刺五加茶[56]的总抗氧化活性提升，而羟自由基与DPPH自由基清除活性却显著下降。以广西六堡茶冠突曲霉（E6）发酵当地的“白毫毛尖”[7]和桑叶茶[50-52]，其DPPH降解能力、总抗氧化能力均有变化。上述研究为冠突散囊菌发酵茶产品的开发奠定了基础。

5.2 谷类和豆类食品加工

冠突散囊菌可利用多种碳源生长，亦被用于谷类和豆类的加工过程，见表2。其发酵的燕麦面酱，色泽鲜艳，酱香浓郁，咸甜适宜，多酚含量为原料燕麦的6倍[61]。添加茯砖茶发酵糯米产生了35种特异性的香味物质，α-淀粉酶、蛋白酶和β-葡萄糖苷酶活性增强，总酚含量提高[62-63]。冠突散囊菌固态发酵甜荞，相比毛霉或根霉，对黄酮和总酚含量的促进作用更强[64-65]；发酵苦荞，清蛋白、球蛋白、醇蛋白和总蛋白的含量增加[66]。以冠突散囊菌（YL-1）固态发酵黄豆[67]和黑豆[68]，总酚、黄豆苷元、金雀异黄酮、大豆异黄酮和总苷元等的含量均显著提高；挥发性物质差异明显，其中酯含量增加，若干醇和醛含量减少。冠突散囊菌发酵的豆渣产品Okara，以两种蒽醌（大黄素和大黄素甲醚）为标志性代谢物，其α-糖苷酶抑制活性更强，能有效降低小鼠餐后血糖水平[69]。研究显示，固态发酵能破坏植物细胞壁或水解细胞壁组分的共价键和不可溶的结合性多酚，导致酚类化合物的释放[65]。上述加工食品中多酚和黄酮含量的升高，与发酵过程中酶的作用，尤其是冠突散囊菌水解酶活性密切相关[65,67]。多酚和黄酮含量的升高，使得冠突散囊菌的谷类和豆类食品体外抗氧化性、自由基清除能力以及糖脂代谢相关酶抑制率等生物学活性增强显著[65-68]。因此，这类发酵制品可作为功能性食品或者天然食品添加剂而成为有效的抗氧化剂。

表2 谷类和豆类经冠突散囊菌发酵前后性状对比Table 2 Comparison of characteristics of different food varieties before/after fermentation by Eurotium cristatum

5.3 中药材深加工

冠突散囊菌被用于中药材的深加工过程，可以有效促进中药的解毒和新型天然产物的产生，提高药效，见表3。人工接种冠突散囊菌发酵银杏叶或种子，可有效脱除银杏毒素和银杏酸，增加总黄酮、聚戊烯乙酸酯和芳香物质的含量[70-72]；发酵茶“金花”茂盛，汤色橙黄明亮，滋味醇和，有金花香气[70]；发酵物抗氧化能力提高，淀粉酶和蛋白酶活性增强[71-72]。葛根经冠突散囊菌固态发酵后，中药味得到显著改善，总黄酮和葛根素含量及抗氧化活性显著增加[73-74]。Xiang等[75]通过靶向代谢组学技术比较了冠突散囊菌和红曲霉发酵前后的姜黄素类化合物，共发现115种姜黄素类化合物，其中有48种结构比较新颖，14种为姜黄中首次发现，31种为发酵姜黄过程中新产生，其中的27种姜黄素类化合物为冠突散囊菌新发酵产生，23种为冠突散囊菌发酵特异性。为刺激其沉默的次级代谢产物合成基因簇的表达，陆承云[76]将冠突散囊菌与桑黄共培养并分别固体发酵金银花（叶）、葛根和黄芪。结果显示，发酵金银花（叶）的木犀草素含量增加，绿原酸、芦丁的含量显著降低，发酵黄芪的总黄酮含量显著提高，药效增加[76]。以保加利亚乳杆菌、凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和冠突散囊菌等食品工业中常用的微生物菌种液态发酵含有皂苷的三七、人参和西洋参几味中药，结果发现，仅冠突散囊菌能有效地将西洋参和高丽参中的其他皂苷成分转化为稀有人参皂苷Rd以及多种未知结构的高保留性皂苷产物[26]。冠突散囊菌发酵有效提高了枸杞[77]和白芷[78]的抗氧化活性以及自由基清除能力。以不同植物内生菌固态发酵“化症回生”口服液的残留药渣，发现来源于茯砖茶的冠突曲霉（CB10002）能有效回收利用药渣中的营养成分，并转化产生2.0 mg/g的羟基大黄素（citreorosein）和7.5 mg/g总蒽醌（anthraquinone）[79]。以冠突散囊菌转化中草药活性成分显示出良好的应用前景。

表3 冠突散囊菌发酵不同中药材前后性状对比Table 3 Comparison of characteristics of different Chinese herbs before/after fermentation by Eurotium cristatum

5.4 其他应用

部分研究关注了对冠突散囊菌的活性代谢产物的开发。通过对液态发酵和提取的条件进行优化，胞外黑色素的产量可达4.27 g/L[29-30]。尹慧慧等考察以甜菜粉等为原料用冠突散囊菌发酵产洛伐他汀的最佳条件，得出最优组合的产量为146.4 mg/kg[80]。此外，将冠突散囊菌制成银纳米微粒（AgNP），对铜绿假单胞菌等多种菌有抑制效果，且表现出与新霉素等的协同抗菌效应[81]，有潜力成为新型抗菌材料。茯砖茶来源的菌株ET1具有较强的降解β-氯氰菊酯和3-PBA的性能[82]，可用于污染环境的生物修复。

6 存在的问题及发展趋势

基于其强适应性、丰富的酶系、多样的活性代谢物和安全性等特性，冠突散囊菌在茶叶、豆谷类及中药材深加工等领域已得到较广泛应用。然而冠突散囊菌虽是潜在的益生菌，尚未被列入国家食品安全微生物名录；发酵过程多以固态为主，液态形式较少[83]。因此，该菌仍有较大的开发空间。代谢物方面，研究多集中于真菌转化基质总化合物库的变化分析，对仅来源于真菌菌丝或孢子的天然产物研究较少，对化合物转化的原因挖掘亦不透彻，可能是未来重要的研究方向。另外，多数基质经冠突散囊菌发酵后，其抗氧化性等生理学活性提高，但具体产生了哪些活性物质及如何发挥作用并不清楚。Zhou等通过在线HPLCPDA-三项-TOF-MS/MS-ABTS系统，筛选并鉴定了冠突散囊菌发酵的白芷中发挥抗氧化作用的5种呋喃并香豆素、5种生物碱和2种聚酮[78]，为此类研究提供了新的思路。综上，未来为使冠突散囊菌在食品加工、中药材加工等领域得到更好的应用，需综合运用多种技术手段在检测发酵过程，分析代谢物动态变化[46,74]，锁定关键酶或相关生物代谢途径[16]，探究菌体本身及其发酵制品的生理学活性及作用机制等方面展开深入细致地研究。