苏熠，程诚，王琪

（南京信息工程大学应用气象学院，江苏 南京210044）

1 引言

近年来，假单胞菌属在生物技术和农业方面具有广阔发展前景，在动植物和人类病原体医学研究方面具有重要意义，因此受到人们越来越多的关注[1]。假单胞菌是重要的植物生长促生菌之一，其能够快速生长，并在根际表现出良好的定殖能力[2]；能够产生抗生素、铁载体和多糖，具有抑制土壤病原体的巨大潜力[3]。假单胞菌属可以利用各种基质作为营养物质，并能在各种对于其他细菌来说很艰难的条件下生存。一些假单胞菌菌株可以通过产生葡萄糖酸从黑云母、长石和磷酸盐等矿物中溶解钾和磷以及其他元素[4～7]，而分泌有机酸是根际细菌溶解含磷矿物的主要途径[4]。由于质子的分泌，植物根际环境通常呈酸性，pH值较非根际土壤低2个单位[8]。另外，一些经过基因工程改造的假单胞菌已经应用于醛酸的高效生产，在食品、化妆品和制药行业广泛应用[9～11]。

产酸假单胞菌对酸的耐受性，不仅能够促使其更有效地风化矿物[12]，而且在其适应酸性环境过程中也起重要作用。微生物内部环境的酸化会增加细胞外渗透性，破坏细胞质中生物大分子的结构[13]。此外，细胞质酸化会破坏细胞膜结构，降低细胞内酶的活性，诱导蛋白质降解并导致DNA损伤[14]，因此细胞内环境的pH值通常接近中性[15]。假单胞菌已知和潜在的耐酸机制包括细胞壁和细胞膜的完整性、外排泵、碱性化合物的合成、能量代谢、DNA损伤修复、生物膜。深入理解假单胞菌菌株的耐酸机制，将有助于进一步深入了解根际周围植物和微生物之间的相互作用与机制，且能为微生物菌肥的研发与应用、土壤有益元素活化、食品防腐工艺开发以及药物研发等提供新的技术途径。

2 耐酸机制

2.1 细胞壁和细胞膜的完整性

当细菌暴露于酸性环境时，细胞膜可能会发生一系列变化，包括囊泡形成、磷脂成分变化和细胞膜通透性降低[16～18]。研究表明，外部酸性环境可以作为细菌细胞壁应激的信号[13]，诱导细胞壁修复酶的合成，防止细胞壁降解。

参与细胞壁和膜合成的物质会对酸性环境产生反应。如，青霉素结合蛋白（MrcA）是参与细胞壁肽聚糖（PNG）合成的主要酶，为构成革兰氏阴性细菌薄壁组织的重要成分[19]。脂多糖（LPS）是膜的主要成分，对膜的稳定性起着重要作用。Kelly等[19]发现，在革兰氏阴性细菌遭受酸胁迫时，负责PNG水解，催化细胞壁聚糖链断裂的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶和裂解转糖苷酶数量降低。

参与膜稳定性的蛋白质在假单胞菌的耐酸性中也起着重要作用。当暴露于高浓度对香豆酸时，ATP结合盒（ABC）转运体中的Ttg2ABC基因缺失会损害恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）KT2440的正常生长[20]。据报道，这种转运体参与了抵抗其他胁迫的过程，如氧化胁迫、重金属和抗生素以及甲苯[21]。外膜脂蛋白（VacJ）与大肠杆菌（Escherichia.coli）和志贺氏菌（Shigella flexneri）的ABC转运系统有关，也被认为与恶臭假单胞菌对于对香豆酸和药物的耐性有关[20]。在细胞膜将被破坏时，VacJ在维持外膜稳定性方面发挥着重要作用[22，23]，并且其缺失会导致外膜渗透性增加[23]。此外，乳酸（LBA）暴露后，荧光假单胞菌的机械敏感性离子通道蛋白上调。这种蛋白质是渗透安全阀，可以防止细胞在低渗透性的休克期间因为膜渗透屏障的短暂损伤而破裂[13]。

2.2 外排泵

外排泵能绕过周质去除细胞中的有毒物质，有效提高细胞在有毒环境中的存活率[24]。通过应用转录组学分析和相关基因的删除，Wang等[12]发现，在添加黑云母的条件下，具有高效矿物风化功能的生氮假单胞菌（P.azotosomes）菌株F77中编码NADH脱氢酶的基因（包括nuoE、nuoF和nuoI）显著上调。NADH脱氢酶和其他NADH-泛素氧化还原酶可以将H+泵出细胞，提高细胞内部的pH值[25]，从而缓解酸的胁迫效应。

超家族转运蛋白（MFS）可促进各种底物（包括离子、糖磷酸盐、药物、氨基酸和肽）在细胞质和内膜上移动[26]。Ma等[27]证实了恶臭假单胞菌菌株KT2440中的MFS2转运蛋白基因簇PP_1271、PP_1272和PP_1273在耐受丙酸（PA）过程中的作用。PA是一种广泛使用的食品防腐剂，对微生物生长具有显著的抑制作用。因此，PA对菌株生长的抑制也是对其高效微生物发酵生产的巨大挑战。PP_1271、PP_1272和PP_1273的过表达不仅促进了菌株KT2440在丙酸钠环境下正常生长，而且还增加了PA产量，这可能是MFS2转运体向细胞外不断运输PA导致的[27，28]。

能识别多种药物的药物外排泵称为多药外排泵，能通过内膜转运从细胞质和周质中向细胞外泵出多种抗生素，导致细菌能同时耐受多种药物[29，30]。乳酸是一种多功能有机酸，天然存在于酸奶等发酵乳制品中，广泛用于食品、医药和精细化学品。当暴露于LBA时，荧光假单胞菌（P.fluorescens）中的耐药-结瘤-分裂（RND）型多药外排泵数量上调。RND外排泵的表达受外界应激因素的影响，如活性氧[31]。因此，外排泵可能是一种通用的菌体自我保护机制的一种，以对抗酸胁迫引起的细胞应激反应。

2.3 碱性化合物的生成

细菌通过产生碱性化合物（包括脲酶、腐胺、亚精胺和NH3+）来抵消细胞质的酸化[32]。尿素酶能特定催化尿素水解成氨（NH3）和二氧化碳（CO2），从而中和细菌微生境中的酸。已有报道表明，提高尿素酶活性是幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的主要耐酸机制[31]，其催化产生的NH3可以作为缓冲液离开菌体细胞的细胞质，以NH4+的形态进入细胞周质空间。精氨酸脱胺酶（ADI）能将精氨酸分解为鸟氨酸、NH3和CO2。这些碱性化合物有助于提高细胞pH值来应对酸性环境[33～35]。例如，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）通过ADI途径产生NH4+，以获得ATP来对抗酸胁迫[36]。

研究发现，生氮假单胞菌（P.azotoformans）F77主要通过生成葡萄糖酸和降低培养基的pH值来加速黑云母风化[12]。在培养基中添加黑云母的条件下，当菌株F77受到酸胁迫时，负责编码碱性物质（如NH3、腐胺和亚精胺）的基因，包括ureD、ureC、ureaA、ureB、urgeG、ureJ、potF和orf02258显著上调。生理试验结果也表明，在黑云母存在的低pH值条件下，F77菌株细胞内NH3+的产生会增加。

2.4 能量代谢

由于耐酸菌株需要从细胞中运送额外的质子来维持细胞内的pH值，因此，跨膜质子能量是细菌很重要的耐酸机制之一[37]。H+-ATP酶是一种由多个亚基组成的酶，具有质子转移膜通道的功能[38]，通过产生ATP为细胞在酸性环境中维持生存提供能量。这种酶可以利用质子驱动力，通过消耗底物水平磷酸化产生的ATP将质子从细胞中排出。因此，较高的H+-ATP酶和能量积累有利于细菌菌株维持pH值稳态[39]。当生氮假单胞菌和嗜热乳杆菌（Lactobacillus thermophilus）分别处于低pH值环境时，H+-ATP酶的转录水平均显著上调[12，40]。

编码成熟细胞色素c系统的基因ccmCDEF和编码硫氧化还原蛋白的基因dsbE对细菌耐受香豆酸意义重大。当暴露于对香豆酸时，ccmF和ccmC的缺失显著抑制了恶臭假单胞菌KT2440的正常生长。细胞色素c成熟系统可以促进血红素基团附着在周质中的脱细胞色素c上，使c型细胞色素在细胞呼吸和ATP合成中发挥重要功能[41]。缺乏对香豆酸耐受性的功能操纵子，会使细胞表现出高能量需求或膜电位的破坏现象，导致细胞色素c的释放[42]。此外，大肠杆菌中参与能量代谢的基因（如nuo和cyo操纵子）相对丰度的增加，也证明能量代谢在由游离脂肪酸引起的应激中起着重要作用[43]。

2.5 DNA损伤修复

乳糖酸（LBA）是一种多功能有机酸，天然存在于酸奶等发酵乳制品中，广泛用于食品、医药和精细化学品[44]。LBA使食品中的主要腐败菌荧光假单胞菌（P.fluorescens）具有良好的抗菌活性。Li等[13]应用全理论片段离子质谱（SWATH-MS）对荧光假单胞菌进行了蛋白质组学分析，发现LBA可能通过细胞内活性氧（ROS）的积累在P.fluorescens中引起氧化应激反应，同时诱导抗氧化酶/解毒酶对抗活性氧。ROS诱导的氧化损伤可能导致DNA损伤。为了应对DNA损伤带来的不利影响，细胞中形成了各种修复机制[45]。在P.fluorescens中，负责多聚磷酸（polyP）合成的多磷酸激酶（PPK）经-LBA处理显著上调。PolyP在各种应激反应、DNA损伤修复、运动和生物膜形成中起着关键作用[46，47]。此外，PPK可以稳定蛋白质，或刺激对高温、酸和氧化条件敏感的高丝氨酸转琥珀酰酶MetA的抑制性变性聚集体的降解，来保护肠沙门氏菌（Salmonella enterica）免受弱有机酸胁迫[48]。LBA暴露后，分别介导核苷酸和碱基切除修复的常见DNA修复蛋白——UvrABC系统蛋白C（UvrC）和外脱氧核糖核酸酶Ⅲ（ExoⅢ）在P.fluorescens上调。总的来说，酸胁迫导致DNA损伤，而PPK、UvrC和ExoⅢ被诱导产生来修复DNA损伤。

2.6 生物膜

生物膜是自然界微生物相互聚集的一种形式，是在细菌、细菌接触表面以及细菌增殖中形成了具有一定三维空间结构的群体，在这个群体的共同作用下，细菌粘附在接触表面并产生了大量胞外聚合物（EPS）[49]。当环境发生变化时，如营养缺乏和酸胁迫，粘附在生物膜中的细菌将继续进化并向相邻细胞传播耐药性，导致群体对不利环境的总体耐药性显著提高[50，51]。如生物膜内的P.fluorescensNCM90也比游离细胞更耐酸性电解水[52]。

在被细菌包裹的生物膜中通常有大量的EPS。这些EPS是一种有效的物理屏障，可以防止酸性物质的渗透或氢离子的消耗[51]，以确保细菌在生物膜中能正常生长。

此外，生物膜的最内层通常没有可消耗的氧气，形成了厌氧环境。同时，一些细胞会可逆地进入缓慢生长或低生长代谢状态[53]，在营养供应受限等应激反应时降低对外部酸性环境的敏感性[54]。存活的菌株会降低生长速度，延长生长恢复时间，增加细菌膜的合成，从而细胞的耐受性增强[55]。

群体感应（Quorum sensing，QS）是一种细胞间信号传递过程，使细菌能够集体控制基因表达，从而协调一些仅在高种群密度下才能产生的活动。S-核糖同型半胱氨酸酶（LuxS）介导的群体感应系统通过LuxS酶的活性产生一种自动诱导剂-2（AI-2）的通用信号分子，一般出现在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中，用于种内和种间通信。LuxS介导的QS可以调节细菌的重要生理特性，如毒力基因表达[56]、细胞运动[57]、生物膜形成[58，59]、对酸和氧化应激的耐受性[60，61]等。乳酸杆菌中，细胞的AI-2活性增加，luxS基因转录显著增加[62]，这表明luxS通过AI-2活性介导的群体感应可能参与酸胁迫应激反应。QS在假单胞菌生物膜的形成中也有重要作用。如，铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）生物膜中胞外DNA（eDNA）的形成受QS系统控制[63]。因此，QS也可能在假单胞菌的耐酸性中发挥潜在作用。

生物膜，尤其是较厚的生物膜，可能为细菌细胞提供一个独特的环境，以充分表达其适应性生存机制。由于三维结构、高细胞密度和扩散障碍，生物膜内不同位置的细菌细胞可能无法同时感受到相同程度的pH值。首先感受到pH值胁迫的细胞可能会迅速处理信息，并通过细胞间信号系统将信号传递给群体中的其他成员，启动针对pH值胁迫的协调保护反应去应对可能致命的酸。与需要达到信号分子和细胞密度的临界浓度的游离细胞不同，生物膜可以让信号分子在局部环境中快速积累，从而更快地启动协调活动[64，65]。此外，在生长速率、生长阶段或代谢活动方面，生活在生物膜中的细菌细胞的生理状态是混杂的。这允许细胞以不同的方式对压力做出反应。显然，生物膜内的菌体细胞相对于游离细胞，有更多的时间、足够的信号分子浓度和较高的群体密度来适应外部环境[66]。

3 总结与讨论

假单胞菌在自然环境中面临各种生物、非生物胁迫，在自然压力的选择下，假单胞菌进化出多种适应性机制，表现出丰富的代谢多样性。假单胞菌在溶解土壤矿物、促进植物生长、防控植物病原菌、生物修复污染物等方面具有重要意义。高通量测序技术和模式生物胁迫机制的建立推动了对重要生物胁迫机制的分析，但是目前关于假单胞菌耐酸机制的研究仍然有限，有待进一步深入研究。

现有关于假单胞菌的研究多采用菌株全基因组分析结合转录组分析等多组学技术，通过比较假单胞菌在有/无酸胁迫条件下转录组或蛋白组的变化，筛选与酸胁迫相关功能基因或蛋白，并结合q-RT PCR、基因敲除对其功能进行验证。但是，相关功能基因对假单胞菌生理生化特性及代谢物的影响仍缺乏深入、系统的研究。今后的研究不仅需要利用多组学技术发掘与假单胞菌耐酸相关的候选基因，更要投入大量精力揭示潜在的耐酸基因功能。