陈阔 欧阳英 何天翔 卢炜琪 尹乐斌

摘 要：目的：筛选出邵阳地区大曲中耐酸、高产淀粉酶微生物并对其相关生物学特性进行研究。方法：采用摇瓶发酵法与碘显色法，从湘窖酒曲中初步筛出3株菌落直径与透明圈直径比值较大的菌株WB4、WB9、WB13，分别将其在室温下放置1 h后，采用DNS法测定其酶活。结果：WB4菌株的酶活力最高，该菌株的最适反应温度为32 ℃，在该条件下获得淀粉酶活性为2.877 U/mL，其最耐受酒精浓度为10%。结论：耐酸、高产淀粉酶菌株WB4的筛选对于酿酒行业具有良好的应用前景，减少了酿酒过程中的酸碱调节步骤，在酸性条件下，许多其他杂菌因无法适应这一条件而被抑制，为工业生产带来了巨大的经济效益。

关键词：邵阳大曲;耐酸;高产;淀粉酶;筛选;鉴定

Screening and Preliminary Identification of an Acid Tolerant and High Amylase Producing Yeast

CHEN Kuo， OUYANG Ying， HE Tianxiang， LU Weiqi， YIN Lebin*

（Colleage of Food and Chemical Engineering， Shaoyang University， Shaoyang 422000， China）

Abstract： Objective： To screen out the acid-tolerant and high-yielding amylase microorganisms from Daqu in Shaoyang area and study their related biological characteristics. Method： Three strains WB4， WB9 and WB13 with large ratio of colony diameter to transparent circle diameter were screened from Xiangjiao distiller’s yeast by shaking flask fermentation and iodine colorimetry. After being placed at room temperature for 1 h， their enzyme activities were determined by DNS method. Result： The enzyme activity of strain WB4 was the highest， and the optimum reaction temperature of this strain was 32 ℃. The amylase activity obtained under this condition was 2.877 U/mL， and its maximum tolerance to alcohol concentration was 10%. Conclusion： The screening of this acid-resistant and high-yielding amylase strain WB4 has good application prospects for the winemaking industry， reducing the acid-base adjustment steps in the winemaking process. Under acidic conditions， many other miscellaneous bacteria cannot adapt to this condition. Inhibition has brought huge economic benefits to industrial production.

Keywords： Shaoyang Daqu; acid tolerance; high yield; amylase; screening; identification

大曲的主要原料是小麥，形状类似砖块，具有丰富的菌系和酶系，是一种酿酒用的糖化剂及发酵剂，且含有多种能水解和发酵底物的产酶微生物。酿酒的主要原料由高粱、小麦、玉米等组成，其中含有大量淀粉，淀粉是自然界中的第二大多糖储备物质，是许多食品与非食品行业的重要组成部分[1]。大曲中能产生淀粉酶的微生物有霉菌、酵母菌、青霉菌和细菌等，其中淀粉酶已被广泛运用于酿酒、纺织与烘焙等行业生产，除动物自身的消化道可分泌一些淀粉酶外，淀粉酶的另外两大来源是植物和微生物[2]。

为解决酿酒过程中淀粉浆液化糖化中的调温度与调节pH等步骤，本文通过考察形态学、生理生化特性，利用液体发酵法对产淀粉酶培养基发酵条件进行优化，从邵阳大曲中筛选出了一株耐酸、高产淀粉酶的酵母菌。而在不同的地域制备的大曲，其微生物多样性可能存在不同。张双燕[3]利用MiSeq高通量技术分析北京地域的清香型大曲微生物多样性，得出真菌中的优势菌是假丝酵母、曲霉属等。胡晓龙[4]使用同样的方法对河南省地域的大曲微生物群落多样性进行分析，得出真菌中优势菌种是扣囊复膜酵母、雪黄散囊菌等。由此得出不同地域的气候、地势环境、大曲制作方法的不同均可能对大曲中微生物的多样性产生影响。对于白酒行业来说，筛选出具有地域特色的高品质微生物能提升出酒率和酒的品质，进而改善传统制曲工艺。故此，对湖南邵阳地区的大曲微生物的筛选与研究显得极为必要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

湖南省邵阳市湘窖酒业有限公司高温包包曲。

1.1.2 主要培养基与试剂

（1）培养基。①初始发酵培养基：可溶性淀粉20 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、自来水1 L、pH 值7.0，121 ℃灭菌25 min。②初选培养基：玉米淀粉20 g、K2HPO4 1.0 g、NaNO3 3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、琼脂粉13 g、氯霉素0.005 g、定容至1 L锥形瓶中，pH值 5.5～6.0，121 ℃灭菌25 min。③马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。④YEPD培养基：酵母粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 mL，115 ℃湿热灭菌20 min。

（2）试剂。硝酸钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、麦芽糖、3，5-二硝基水杨酸、酵母膏和琼脂粉等由邵阳学院生化实验室提供;氯霉素购于药店。

1.1.3 主要仪器设备

LE438型pH计：梅特勒-托利多仪器上海有限公司;DH-420型电热恒温培养箱：北京科伟永兴仪器有限公司;UV-3802型紫外分光光度计：重庆万达仪器有限公司;H21-6型电热恒温水浴锅：北京市东霞电子仪表厂;JI54DWS型高压蒸汽灭菌锅：致微厦门仪器有限公司等。

1.2 试验方法

1.2.1 大曲发酵

取1 g大曲接种于发酵培养基中，40 ℃，150 r/min振荡培养24 h。

1.2.2 菌株初筛

取发酵培养液1 mL，于99 mL的无菌水三角瓶中，振荡均匀，即为稀释度10-2的粉末悬液。再依次进行梯度稀释，获得稀释度为10-3、10-4、10-5和10-6的大曲稀释液。分别取10-4、10-5、10-6稀释液0.1 mL涂布于筛选平板上，28 ℃恒温箱中培养24 h。挑取培养基上不同形态的菌落进行平板划线，得到单个菌落。喷洒碘液，若菌落出现白色透明圈，则说明此菌可产生淀粉酶，挑选有透明圈的菌落备用，并制作表格統计D/d值，初步筛选产淀粉酶菌株。

1.2.3 菌株复筛

高产淀粉酶菌株的筛选：将初筛出的纯菌种接种于250 mL发酵培养基中，37 ℃、250 r/min摇床培养2 d。取发酵液1 mL于8 000 r/min下离心10 min，取上清液测酶活力，每个样品重复3次，结果取平均值。

1.2.4 耐酸性筛选

将筛选出的两株高产性菌株分别同时接种于YPED液体培养基中，28 ℃恒温培养1 d，种子活化液浓度为1.0×107 CFU/mL，设置5个不同梯度的pH值，pH分别为2.5、3.0、3.5、4.0和4.5，28 ℃恒温培养箱中培养3 d，吸取2×105 CFU/mL菌液1 mL于上述不同pH值的100 mL YPED液体培养基中，利用紫外分光光度计测定560 nm下菌液的OD值，OD值越大，菌株的耐酸性越强[5-6]。

1.2.5 酶活测定方法

（1）测定方法。采用DNS法[7]测菌株的酶活力，以麦芽糖绘制标准曲线，测定试验菌株在520 nm的吸光度。

（2）标准曲线的绘制。①取16支洁净比色管分别编号1、2、3、4、5和6（除6号试管1支外，其他每组编号各3支），用蒸馏水冲洗，于培养箱中烘干，之后分别往比色管中依次加入0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL和2.0 mL麦芽糖标准溶液，DNS指示剂，蒸馏水（加入量参考文献[8]）。②摇匀后于沸水中加热5 min，冷却后，各试管用蒸馏水定容至25 mL，试管6作为对照组，其他组平行试验3次且结果取平均值。③测定试验菌株在520 nm的吸光度，以麦芽糖量为横坐标，吸光光度值为纵坐标，得到麦芽糖含量的回归方程。

（3）酶活力单位定义。在40 ℃、pH值 6.0的条件下，每分钟从1%的可溶性淀粉中释放出1 mmol麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）[9]。

1.2.6 菌落形态观察

将初筛后的菌株平板划线，纯化，在28 ℃恒温培养箱中培养3 d，用美蓝与棉蓝溶液分别对酵母菌与霉菌进行镜检。观察平板中菌落的颜色、大小、表面的粗糙程度、镜检下的孢子形态以及菌株菌丝状态等，并且参照《真菌鉴定手册》[10]进行比较。

1.2.7 菌株生物学特性测定

（1）温度对菌株产淀粉酶能力的影响。将待测菌株接种于发酵培养基中，分别在24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃ 5个温度下培养，180 r/min条件下振荡培养2 d，取2 mL酶液进行酶活性测定。每组设3个平行样，每个样品重复3次，结果取平均值[11]。

（2）酒精浓度对菌株产淀粉酶能力的影响。以5%的菌液种量接种到酒精浓度为2%、4%、6%、8%和10%的高粱汁培养基中，在28 ℃，180 r/min条件下振荡培养2～3 d，取2 mL酶液进行酶活性测定。每组设3个平行样，每个样品重复3次，结果取平均值。

（3）酸碱度对菌株产淀粉酶的影响。以5%的菌液接种量接种到pH值 2.5、pH值 3.0、pH值 3.5、pH值 4.0和pH值 4.5的高粱汁培养基中，在28 ℃，180 r/min条件下振荡培养2～3 d，取2 mL酶液进行酶活性测定。每组设3个平行样，每个样品重复3次，结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 耐酸、高产淀粉酶菌株的筛选结果

2.1.1 淀粉酶标准曲线绘制

淀粉酶标准曲线见图1，该方程为y=0.268 9x+0.0565 5，R2=0.991 9。

2.1.2 高产淀粉酶菌株的筛选

从大曲中初篩分离得13株菌株，根据培养基的颜色与菌落形态，初步观察判定为酵母菌、毛霉、青霉与黄曲霉，因黄曲霉会产生黄曲霉毒素，其是一类有毒的次生代谢产物，且广泛存在于农作物及食物中，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为“Ⅰ”类致癌物，故复筛时将黄曲霉剔除，选取酵母菌、毛霉与青霉中透明圈直径与菌落直径较大的3株菌株进行复筛，测定其酶活性[12]。由表1可知，WB4与WB9的酶活性最高，说明这两株菌株的产酶能力较好。

2.1.3 耐酸淀粉酶的筛选

将WB4与WB9分别接种于pH为2.5、3.0、3.5、4.0和4.5的YEPD培养基中恒温培养3 d。由表2可知，在波长560 nm下，且pH在2.5～4.5，随着pH的变化，WB4与WB9的OD值至均高于前一梯度的OD值。传统酿酒工艺中，在糖化之前需将醪液pH值由6.5降到4.5，以便糖化酶活性的最大化。因pH在4.5的条件下，WB4的酶活性更高，故WB4即为所要筛选耐酸、高产淀粉酶微生物。耐酸性以及酶活结果如表2所示。

2.2 产淀粉酶菌株形态学鉴定

从初选培养基中分离出3种不同形态的菌株，再进行纯化，观察菌落形态与孢子特征，如图2所示。由图2可知，在28 ℃条件下，将菌株WB4、WB9、WB13培养3 d，其中WB4与WB13菌落呈乳白色，表面呈圆形且凸起，菌落较小，边缘较为规则，菌落中单个细胞宽度约2～3 nm，长度5～6 nm，呈椭圆形，初步鉴定该菌株为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。WB9菌落呈雪白色，表面黏稠、湿润，边缘不规整，菌落较大，菌落中单个细胞直径约2～3 nm，呈卵圆状，初步鉴定为粉状米勒酵母（Millerozy mafarinose）。实验菌株形态特征与《真菌鉴定手册》和文献[13]鉴定结果一致。

（a）WB9的菌落形态、菌丝形态以及分生孢子形态

（b）WB4的菌落形态、菌丝形态以及分生孢子形态

（c）WB13的菌落形态、菌丝形态以及分生孢子形态

图片从左至右依次为菌落形态、菌丝形态（×100）及分生孢子（×400）形态图。

2.3 菌株培养条件优化

2.3.1 温度对菌株WB4产淀粉酶能力的影响

将菌株分别在24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃与

40 ℃ 5个温度下培养2 d后，用DNS法测定其酶活性，结果如图3所示。由图3可知，菌株WB4在32 ℃时，酶活性最高，平均OD值为2.877;当温度低于32 ℃时，菌株的酶活性相较之下较低;当温度高于32 ℃时，酶活性显著降低。因此，确定菌株WB4的最适温度为32 ℃。

2.3.2 酒精浓度对菌株WB4产淀粉酶能力的影响

将WB4的种子液加入含有100 mL的酒精浓度为2%、4%、6%、8%和10%的高粱汁培养基的锥形瓶中，贴好标签，置于28 ℃恒温培养箱中培养2～3 d后，用DNS法测定其酶活性，结果如图4所示。由图4可知，当酒精浓度在2%～8%时，WB4菌的OD值是缓慢下降，但酒精浓度在8%～10%时，WB4的OD值下降较快。因此，WB4菌株的耐酒精浓度为10%。

3 结论

本研究从湖南省湘窖酒业有限公司中高温包包曲中筛选出13株产淀粉酶的菌株，并对这13株菌株进行初步的形态学观察，判定为酵母菌、毛霉、青霉与黄曲霉4种菌株，因为黄曲霉会产生黄曲霉毒素，故不进行后续操作;其他菌株通过酶活性大小鉴定，得WB4与WB9这两株菌株的产淀粉酶能力较强;将WB4与WB9这两株菌株接种于YPED液体培养基中，再通过DNS法对其进行酶活性大小比较，最终获得一株耐酸、高产淀粉酶菌株WB4;经过形态学观察，鉴定该菌株为酿酒酵母;通过液体发酵法确定该菌株产酶的最佳条件为：温度为32 ℃，酒精浓度为10%。本试验通过筛选耐酸性和高产性的酿酒微生物，有效解决了酿酒糖化过程前的酸碱调节问题，减少酿酒过程中不必要的环节，节约了时间，能够有效提高工业生产的产酒率，降低酿酒生产成本。

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基金项目：湖南省大学生创新创业训练计划项目（湘教通〔2020〕191号-3406）;国家级大学生创新训练项目（S202010547049）。

作者简介：陈阔（2001—），男，湖南长沙人，本科在读。研究方向：微生物。

通信作者：尹乐斌（1982—），男，江西乐安人，博士，副教授。研究方向：果蔬加工。E-mail：112608803@qq.com。