李天佑 薛朝金 陈 璐 何 羽 蔡远东

贵州省毕节市市场监督管理局检验检测中心，贵州 毕节 551700

小儿生血糖浆处方由熟地黄、山药、大枣、硫酸亚铁组成，具有健脾养胃、补血生津的功效，用于治疗小儿营养不良性贫血和缺铁性贫血[1]。熟地黄可补血、滋阴；大枣可益中生血、补脾和营、养心安神；山药可补血生精、养胃益肺。三味药均具有补血的功效。由于原标准中没有薄层色谱鉴别和含量测定，为更加全面有效控制药品质量，经阅读参考相关文献后，对处方中大枣及山药进行薄层色谱法鉴别，对熟地黄所含成分毛蕊花糖苷进行含量测定，以为后续药品质量研究、标准提升及药品检验提供一定的参考价值。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(包括 Agilent LC工作站，1260 DAD VL检测器，自动进样器，四元梯度泵，柱温箱)，PS-G60A型洁康超声波清洗机(功率：360W；频率：40KHz)；ATSmol 1850C型超纯水机(重庆市安特生环保设备有限公司)，MSE3.6P-OCE-DM型电子天平(百万分之一)和AY120型电子天平(万分之一)。

1.2 试药 小儿生血糖浆样品为某药品生产企业生产药品(批号为:20190406， 20191103， 20200601)。阴性样品自制所得(按小儿生血糖浆处方和制法分别制备缺熟地黄、山药和大枣的阴性样品)。大枣对照药材(批号:121040-201408)、齐墩果酸对照品(批号:110709-201206)、白桦脂酸对照品(批号:111802-201001)、山药对照药材(批号:121137-201807)、毛蕊花糖苷对照品(批号：111530-201914、95.2%)均由中国食品药品检定研究院提供。熟地黄、山药及大枣药材经鉴定均为正品。乙腈为HPLC级(美国，Tedia试剂公司)；水为纯净水(娃哈哈)；硫酸亚铁、乙醚、二氯甲烷、甲醇等均为分析纯；硅胶G薄层板为预制板(青岛海洋化工有限公司，批号：20170216)。

2 方法与结果

2.1 大枣薄层色谱鉴别 取上述三批样品各5 mL，分别加乙醚30 mL，超声处理30 min，置分液漏斗中，取乙醚层，蒸干，残渣加乙醚2 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺大枣阴性样品5 mL，同法制成阴性对照溶液。另取大枣对照药材2g，加乙醚30 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醚2 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取白桦脂酸对照品和齐墩果酸对照品，加乙醚制成各含1 mg/ mL的混合对照品溶液。照薄层色谱法(2020年版中国药典四部通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各10 μL、混合对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(7∶2∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，置105 ℃加热至斑点显色淸晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点,阴性对照溶液无干扰,如图1 A所示。

2.2 山药薄层色谱鉴别 取上述三批样品各15 mL，分别加二氯甲烷50 mL，加热回流提取1 h，置分液漏斗中，取二氯甲烷层，蒸干，残渣加二氯甲烷2 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺山药阴性样品15 mL，同法制成阴性对照溶液。另取山药对照药材3 g，加二氯甲烷50 mL，加热回流提取1 h，过滤，滤液蒸干，残渣加二氯甲烷2 mL使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(2020年版中国药典四部通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性对照溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液(18∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，置105 ℃加热至斑点显色淸晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点,阴性对照溶液无干扰，如图1B所示。

2.3 毛蕊花糖苷含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为:MedJenBond HPLC Column Camasil C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)；以乙腈-0.1%冰醋酸(16∶84)为流动相；流速为1 mL· min-1；检测波长为334 nm；柱温为35 ℃；进样量为10 μL。理论塔板数按毛蕊花糖苷峰计算，应不低于5000。

2.3.2 溶液的制备 对照品溶液的制备：取毛蕊花糖苷，精密称取6.272 mg，置50 mL容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为备用液。精密量取备用液1 mL，置10 mL容量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密吸取小儿生血糖浆样品(批号为:20200601)5 mL，加甲醇50 mL，水浴加热回流提取50 min，过滤，滤液蒸干，残渣加流动相溶液溶解，转移至20 mL量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

阴性对照溶液的制备：取缺熟地黄阴性样品5 mL，按2.3.2项下供试品溶液的制备方法，制备得阴性对照溶液。

2.3.3 方法特异性试验 将对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液按照2.3.1项下的色谱条件分别进样分析。结果如图2所示，对照品溶液毛蕊花糖苷成分色谱峰与供试品溶液毛蕊花糖苷成分色谱峰相应保留时间一致，供试品溶液毛蕊花糖苷成分分离度大于1.5，并且阴性对照溶液无干扰。

2.3.4 线性关系的考察 精密量取2.3.2项下的对照品备用溶液0.2、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加流动相溶液稀释至刻度，摇匀，按照2.3.1项下的色谱条件，每份平行进样2次，以平均峰面积(y)为纵坐标，以毛蕊花糖苷的质量(x)为横坐标进行加权线性回归，得到线性回归方程为：y=15075x-4.6136，r=0.9994(n=6)。结果表明毛蕊花糖苷在2.42～84.91 μg质量范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验 精密吸取2.3.2项下的对照品溶液，按照2.3.1项下的色谱条件，连续进样6次，得出毛蕊花糖苷峰面积值的RSD值为0.29%(n=6)。结果表明仪器的精密度良好。

2.3.6 稳定性试验 精密吸取2.3.2项下的供试品溶液，按照2.3.1项下的色谱条件，分别于0、4、6、8、12、16、24 h时进样分析，得出毛蕊花糖苷峰面积值的RSD值为1.43%(n=7)。结果表明供试品溶液中毛蕊花糖苷成分在室温下24 h内比较稳定。

2.3.7 重复性试验 取同一批样品(批号:20200601)5份，每份精密量取5 mL，按2.3.2项下供试品溶液的制备方法，制备得供试品溶液，按照2.3.1项下的色谱条件进样分析，得出毛蕊花糖苷峰面积的RSD为 0.21%。结果表明此方法的重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取已知毛蕊花糖苷含量的同一批样品(批号:20200601)9份，每份精密量取5 mL，分别精密加入定量的毛蕊花糖苷，按2.3.2项下供试品溶液制备方法制备，按照2.3.1项下的色谱条件进样分析，结果得出平均回收率为97.1%, RSD为0.56%，结果说明此方法具有良好的回收率。见表1。

表1 小儿生血糖浆中毛蕊花糖苷成分的加样回收率试验结果 (n=9)

2.3.9 小儿生血糖浆样品中毛蕊花糖苷的含量测定 取上述3批小儿生血糖浆样品，每批取样2份，按2.3.2项下供试品溶液制备方法制备溶液，按照2.3.1项下的色谱条件进行进样测定，计算毛蕊花糖苷的含量。结果见表2。

表2 HPLC法测定小儿生血糖浆中毛蕊花糖苷有效成分的量 /mg/mL

3 讨论

大枣薄层色谱鉴别[2-4]曾考察甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(7∶2∶0.5)与石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(7∶2∶0.5)的展开效果。因考虑到甲苯毒性强，环境污染大，故选择石油醚(60～90 ℃)替代甲苯进行试验，结果表明，其展开后斑点清晰、分离效果好、阴性无干扰。

山药薄层色谱鉴别[5-7]曾用酸水解法[8]提取供试品中薯蓣皂苷元进行薄层色谱鉴别[9]，但发现在阴性中干扰较大，后参考了2015版《中国药典》中“山药”和“九味肝泰胶囊”中山药薄层鉴别方法，结果斑点较多、分离效果好、阴性无干扰。

毛蕊花糖苷含量测定[10-12]2010版《中国药典》一部和2015版《中国药典》一部均对熟地黄药材中指标成分毛蕊花糖苷进行含量测定，为加强该制剂中熟地黄药材的质量控制，故参考了2015版《中国药典》中“熟地黄”中含量测定方法。曾考察提取溶剂水、甲醇、乙醇，发现水为提取溶剂时粘度太大，不易过滤，提取溶剂为乙醇时，样品容易结块，提取效率不高。甲醇为提取溶剂超声提取、回流提取及时间的比较，相同提取时间内水浴回流提取效率高，且水浴回流提取在40 min后提取量无明显增加，为保证提取充分性，故最终选择以甲醇为提取溶剂，水浴加热回流50 min。曾考察流动相体系(水-乙腈、0.1%磷酸溶液-乙腈、0.1%冰醋酸溶液-乙腈)，结果流动相为乙腈-0.1%冰醋酸溶液时毛蕊花糖苷成分峰型及分离度最好。

本研究在原标准基础上增加了山药、大枣薄层色谱定性鉴别和毛蕊花糖苷高效液相色谱法定量测定；其定性方法准确，操作简便，斑点清晰且分离效果好，阴性对照无干扰，专属性强。其定量方法精密度高，峰形好，重复性高，方法特异性及稳定性均能达到要求。结果表明，所建立方法能有效的控制小儿生血糖浆处方中大枣、山药及熟地黄药材的质量，适用于小儿生血糖浆的质量控制，提升了小儿生血糖浆的质量标准。