李 姗，乔金柱，李 烨，贾丁柔，刘 刚，王冬梅

（河北农业大学 华北作物改良与调控国家重点实验室/河北省植物生理与分子病理学重点实验室/ 生命科学学院，河北 保定 071001）

小麦作为中国的第3 大粮食作物，一直是国家粮食安全的保障［1］。由叶锈菌（Puccinia triticina）引起的小麦叶锈病，在全球范围内分布广泛，流行年份可造成严重的产量损失，因此备受人们关注［2］。目前解决这个问题最有效的方法就是寻找抗性基因，培育转基因抗病品种［3-4］。针对不同的叶锈病原菌，小麦在抵抗其侵染的过程中进化出相应的抗病基因来识别并激活其下游的抗病因子［5-6］。然而叶锈菌为了生存也进化出具有更强致病性的菌株，导致原有小麦品种的抗性不断“丧失”，引起锈病的重新爆发，这也成为锈病防控中的国际性难题［7］。因此，挖掘持久广谱抗性基因就显得尤为重要了。

植物在进化中形成了系统的防御机制抵御病原菌侵染，其中系统获得抗性（Systemic acquired resistance, SAR)为寄主提供了持久的广谱抗病作用［8］。

NPRs(Nonexpression of pathogenesis-related genes，NPRs)是一类参与植物病害抗性调控的关键因子，可诱导植物产生系统获得抗性［9］。1994 年，Cao 等在拟南芥突变株中首次发现NPR1，该突变株缺乏SA、INA 应答，导致了某些病程相关蛋白的表达遭到破坏，并丧失SAR［10］。Dong 等经EMS 诱变也得到npr1突变株，并利用图位克隆技术获得NPR1序列，分析发现NPR1 蛋白包含N 末端的BTB/POZ 结构域，Ankyrin 重复结构域和C 末端激活结 构域［11-12］。

NPR1作为SAR 信号转导过程中位于SA 下游并发挥重要作用的关键因子，对植物广谱抗性的调控起着关键作用［13］。因此，对于植物NPR1基因的功能研究不仅成为植物抗病信号传导的研究热点，也成为了植物抗病基因工程领域的重点关注对象。目前，人们对NPR1的研究已经积累了一些数据，除了模式植物拟南芥，在其他多种植物中也都获得了NPR1及其同源基因，并对其基因功能进行了分析［14-18］。有证据表明，在缺乏AtNPR1时，会引起拟南芥中病程相关基因的表达降低，导致拟南芥的抗病性减弱［10］。与之相反，过表达AtNPR1会增强拟南芥抗病基因的表达，抑制丁香假单胞菌的生长［11］。因此，AtNPR1在拟南芥免疫反应中起着不可或缺的作用。同样将OsNPR1在水稻中过表达，也增强了水稻抗白叶枯病的能力［19］。此外，在草莓中过表达AtNPR1基因，增强了寄主对炭疽病等病害的抗性［20］。将香蕉中的2 个NPR1基因MNPR1A及MNPR1B转入npr1突变体中，发现可以恢复npr1突变体的抗性［21］。因此，NPR1可增强多种植物对不同病害的抗性，表现出明显的 广谱抗性。

小麦往往以过敏性反应（Hypersensitive reaction, HR）的形式抵抗叶锈菌的侵染，HR 属于植物抗病的ETI 范畴［22］。而NPR1作为SAR 中的关键基因，能否在ETI 类型的抗病反应中起作用还不清楚。我们对拟南芥AtNPR1进行结构分析，获得与其同源的小麦TaNPR1，该基因在小麦抵抗赤霉病的研究中也发挥着重要作用［23］。本课题组通过转录组数据分析，发现TaNPR1在不同亲和性组合中的表达趋势不同。在此基础上，本试验利用qRT-PCR 进一步分析了TaNPR1在小麦与叶锈菌不同亲和性组合中的表达变化，并借助病毒介导的基因沉默（VIGS）技术沉默TaNPR1基因的表达以探讨TaNPR1在叶锈菌侵染小麦诱发的HR 中的功能。本研究将拓展人们对TaNPR1在小麦抵御叶锈菌侵染中的功能定位，为培育抗病小麦品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物与叶锈菌

选 用 小 麦（Triticum aestivum） 近 等 基 因 系TcLr26和Thatcher（ 简 称Tc）， 本 生 烟 草（N. benthamiana）和叶锈菌（Puccinia triticina）生理小种260。小麦近等基因系与叶锈菌生理小种分别形成不亲和组合TcLr26×260 和亲和组合Tc×260。叶锈菌的繁殖在感病品种‘郑州 5389’上进行。

小麦种子萌发后生长7 d，在第1 片真叶展开时接种叶锈菌生理小种260。然后在黑暗下保湿16 h左右，再将幼苗转移至温室继续培养。小麦和烟草种植及叶锈菌接种参考Gu［24］等的方法。

1.2 TaNPR1 基因的表达分析

小麦幼苗在接种叶锈菌后不同时间点取接种叶片，取样时间为接种后0、4、8、12、16、24、48、72、96 和120 h。样品使用液氮速冻，随后使用冷冻研磨仪将冷冻叶片粉碎。利用Trizol (生工，上海)试剂盒介绍的方法提取总 RNA，依据 TaKaRa 反 转 录 试 剂 盒 PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大连 )合成 cDNA。

对TaNPR1进行序列分析，设计qRT-PCR 特异性引物，如表1 所示，以GAPDH作为内参基因以排除随机误差。

表1 引物列表Table 1 Primer used in the experiment

相对表达量计算方法如下：

ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（内参基因）ΔΔCt=ΔCt（处理样本）-ΔCt（对照样本）相对表达量=2-ΔΔCt

1.3 TaNPR1 的亚细胞定位

设计TaNPR1编码区引物，分别在上下游引物两端添加Hind Ⅲ 和KpnⅠ 酶切位点，见表1。以TcLr26 的cDNA 为模板，扩增TaNPR1编码区全长，长度为1 743 bp。随后与pSuper1300-GFP 载体连接，转化农杆菌GV3101。农杆菌侵染烟草的浓度OD600=0.6 ～0.8，将侵染后的烟草在黑暗下保湿24 h，取出后再继续培养至60 h 左右，利用OLYMPUS BX53F 荧光显微镜观察488 nm 波长下的GFP 绿色荧光分布。

1.4 利用BSMV-VIGS 技术探究TaNPR1 基因的功能

设计TaNPR1特异性片段引物，见表1。构建VIGS 载体并将其命名为BSMV:TaNPR1，酶切线性化BSMV:α、BSMV:β、BSMV:γ、BSMV:TaNPR1和BSMV:PDS。通过体外转录获得病毒RNA，以不同组合混合形成对照组、试验组和指示组，见表2。以摩擦接种法接种到7 日龄的TcLr26 幼苗第一片真叶上，具体操作步骤参照Gu 等［24］的方法，在黑暗保湿箱中培养12 ～16 h。待沉默PDS的指示组叶片出现明显白化现象时，证明病毒成功侵染小麦叶片，此时在第3 片叶上接种叶锈菌生理小种260，在接种后48 和120 h 取接种叶片，一部分剪成1 cm长叶片置于青霉素小瓶中做Rohringer 染色观察，一部分用于以qRT-PCR 检测基因的沉默效率。其中Rohringer 染色参照祁艳等［25］方法进行。在目的基因沉默植株的叶片上，统计50 个单侵染点HR 面积及吸器母细胞（Haustorium mother cells，HMC）数量。

表2 VIGS 组合Table 2 Combinations used in VIGS

2 结果及分析

2.1 小麦与叶锈菌互作过程中TaNPR1 的表达 模式

采用qRT-PCR 检测TaNPR1在不同亲和性组合中的表达趋势，结果如图1 所示。在亲和组合（Tc×260）中，接种初期（4 h）TaNPR1表达量最高，比0 h 上调5.7 倍，随后其表达量逐渐下降。在不亲和组合（TcLr26×260）中，其表达量在接种后早期虽有较高水平表达，但其表达量低于亲和组合；在接种后期（24 ～120 h）该基因的表达均高于亲和组合，且持续保持在较高的表达水平。这一结果表明TaNPR1参与小麦抵抗叶锈菌侵染过程，可能在不亲和组合中对HR 发挥正调控作用。

图1 小麦与叶锈菌互作过程中TaNPR1 的表达分析Fig. 1 Expression analysis of TaNPR1 in the interaction bettwen wheat and Puccinia triticina

2.2 TaNPR1 的亚细胞定位观察

蛋白质的亚细胞定位决定了其发挥功能的场所，是决定其参与生物学过程的重要因素。为此通过构建TaNPR1 与GFP 融合的植物表达载体，我们进一步分析了TaNPR1 的亚细胞定位，结果如图2 所示。

图2 TaNPR1 亚细胞定位的荧光观察（Bar=20 μm）Fig. 2 Fluorescence observation of the subcellular localization of TaNPR1（Bar=20 μm）

在荧光显微镜下我们观察到TaNPR1-GFP 融合蛋白的荧光在细胞质和细胞核中均有分布。

2.3 TaNPR1 基因沉默影响HR 的发生及叶锈菌的发育

HR 是小麦抵抗叶锈菌侵染的重要防卫反应，在不亲和组合中，寄主通过产生HR 来限制叶锈菌的发育。本试验利用VIGS 技术沉默TaNPR1基因，以期对TaNPR1在小麦与叶锈菌互作过程中的功能进行初步探讨。首先通过qRT-PCR 检测目的基因沉默效率（见图3），接菌后48 h 取样的植株中，TaNPR1的沉默效率为72%，接菌后120 h 取样的植株中TaNPR1的沉默效率为60%。将TaNPR1被有效沉默的植株叶片进行Rohringer 染色，通过荧光显微镜观察单侵染点处HR 面积以及叶锈菌HMC的发育（见图4）。我们对50 个单侵染点的HR 面积以及HMC 数量进行统计分析（见图5），与对照组相比，沉默TaNPR1基因的植株在接菌后48 以及120 h，发生HR 的细胞面积变大，叶锈菌HMC 数量增多，说明沉默TaNPR1后使小麦对叶锈菌生理小种260 的抗性减弱。

图3 TaNPR1 沉默效率检测Fig. 3 Silence efficiency detection of TaNPR1

图4 TaNPR1-VIGS 植株叶片的 rohringer 染色及观察（Bar=100 μm）Fig. 4 Rohringer staining and observation of TaNPR1-VIGS plants (Bar=100 μm)

图5 50 个单侵染点的HR 面积及HMC 数量统计Fig. 5 Statistic analysis of HR area and HMC number of 50 single infection

3 讨论与结论

NPR1最早在模式植物拟南芥中被发现，迄今已在拟南芥中发现了6 个NPR基因，根据其功能将其 命 名 为AtNPR1、AtNPR2、AtNPR3、AtNPR4、AtNPR5、AtNPR6［11,26-27］。随后人们相继在水稻［28］、玉米［29］等植物中发现了NPR1同源基因，并证明NPR1 具有系统广谱抗病性。本课题组克隆获得了小麦TaNPR1基因，并对其在小麦抗叶锈病中的功能进行了初步分析。

2018 年，Wang 等分析了小麦和大麦中获得抗性（Acquired resistance，AR)、系统免疫（Systemic immunity，SI） 和Benzothiadiazole 诱 导 的 抗 性（BTH-induced resistance，BIR)特征，并与模式植物拟南芥和水稻中的SAR 特征进行比较，主要介绍了SAR 下游基因的研究进展，包括抗病相关（PR）基因和BTH 诱导的基因，重点关注了SAR 中关键因子NPR1的下游相关基因在抗病中的作用［30］。近期Wang 等报道了NPR1 同源蛋白在小麦抵抗锈菌中的功能及分子基础，以及在不同逆境条件下NPR1同源蛋白不同结构域所发挥的作用［31］。小麦往往以HR 的形式抵抗叶锈菌的侵染，HR 属于植物防御反应的ETI 范畴。而NPR1作为SAR 中的关键基因，能否在ETI 抗病反应中起作用，目前证据还很少。

本课题组通过对小麦与叶锈菌互作的转录组数据库进行分析，发现TaNPR1在不同亲和性组合中表达模式不同。随后，进一步利用qRT-PCR 检测了TaNPR1在小麦与叶锈菌不同亲和性组合中的表达变化。在亲和组合中，TaNPR1在侵染初期表达量较高，随后逐渐下降；而在不亲和组合中，与对照相比，整体呈现较高表达的趋势，尤其在接种后期（24 ～120 h）该基因的表达均高于亲和组合。这一结果暗示TaNPR1参与小麦抵抗叶锈菌侵染的过程，可能对小麦抗叶锈性发挥正调控作用。

根据之前文献报道，NPR1 的定位受到外界刺激的影响。正常情况下主要以多聚体形式位于细胞质中，而当植物受到病原菌侵染后，体内SA 水平升高，NPR1 则解聚为单体，入核与TGA 相互作用，调控下游靶基因的表达［32］。通过对TaNPR1的定位分析，本研究结果也显示TaNPR1主要存在于细胞质和细胞核中，在叶锈菌侵染小麦后是否会影响TaNPR1亚细胞定位的改变仍需要进一步探究。本课题组借助VIGS 技术进一步分析了TaNPR1在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中的功能，在不亲和组合中沉默TaNPR1，发现沉默植株中的HR 面积与对照组相比变大，HMC 数量与对照组相比增多，证明植株抗性减弱。这一结果说明TaNPR1影响小麦抗叶锈菌HR 的发生，正调控小麦对叶锈菌的抗性。然而，TaNPR1在小麦抗叶锈病中的具体分子机制及信号转导还不清楚，仍需进一步设计试验进行探究。综上所述，本研究通过分析TaNPR1的表达模式及其对HR 和叶锈菌HMC 的影响，初步确认TaNPR1正调控小麦抗叶锈病的能力，为小麦抗病育种提供理论依据，也为进一步挖掘小麦广谱抗性基因奠定基础。