王红霞，张月华，刘 敏，陈小建，唐小燕

中南大学湘雅医学院附属海口医院/海口市人民医院：1.儿科；2.中心实验室，海南海口 570208

EB病毒(EBV)属于疱疹病毒科γ亚科家族成员之一，是引起儿童呼吸道感染的重要病毒之一，相关研究表明，有将近90%的人群EBV都处于潜伏感染状态，而EBV感染是呼吸道感染疾病的重要病原体，其在儿童支气管炎、肺炎及上呼吸道感染疾病中较为常见[1]。EBV会感染B淋巴细胞，导致其永生化，其在心理应激条件下重新激活，减轻细胞免疫，EBV感染已被证实发生于多种疾病的子集当中，如癌症及自身免疫性疾病等，亦会引起肝肾功能损伤[2]。年龄相对较小的EBV感染患儿的临床症状大多不典型，但急性感染时病毒载量较高，可引起患儿急性肝功能衰竭，当患儿症状为消化系统、呼吸系统及血液系统症状时，会增加临床诊断的难度，极易导致漏诊情况的发生，致使患儿的治疗时机被耽误，影响患儿预后[3-4]。鉴于此，本文通过研究EBV感染患儿EBV-DNA载量与机体免疫状态及肝肾功能的相关性，以期为EBV-DNA阳性患儿的临床治疗提供数据支持，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年5月至2019年5月本院收治的90例EBV-DNA阳性患儿为研究对象。纳入标准：(1)符合EBV感染相关诊断标准[5]；(2)经实时荧光定量PCR确定EBV-DNA载量≥5×102copy/mL；(3)年龄5个月至9岁，病历资料完整；(4)入院前尚未接受相关抗感染治疗。排除标准：(1)伴有其他感染性疾病或免疫性疾病者；(2)因各种原因无法完成相关研究调查者。本研究经本院医学伦理委员会批准，患儿家属均签署知情同意书。按照EBV-DNA载量的差异进行分组[6]，分成低载量组(<5×104copy/mL)44例、中载量组(5×104～5×105copy/mL)24例和高载量组(>5×105copy/mL)22例，另选取同期于本院接受体检的健康儿童50例作为对照组。低载量组中男患儿25例，女患儿19例；年龄5个月至9岁，平均(4.52±1.23)岁；疾病分布：上呼吸道感染28例，下呼吸道感染16例。中载量组中男患儿14例，女患儿10例；年龄6个月至9岁，平均(4.63±1.25)岁；疾病分布：上呼吸道感染15例，下呼吸道感染9例。高载量组中男患儿13例，女患儿9例；年龄6个月至9岁，平均年龄(4.54±1.28)岁；疾病分布：上呼吸道感染14例，下呼吸道感染8例。对照组中男29例，女21例；年龄7个月至10岁，平均年龄(4.60±1.27)岁。各组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，低载量组、中载量组、高载量组疾病分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1标本采集 采集所有研究对象清晨空腹静脉血5 mL，分成1、2、2 mL置于无菌试管中，1 mL血标本加入含1 mL淋巴细胞，以2 000 r/min离心20 min，采集中间白色云雾状细胞层保存用于检测EBV-DNA载量；一份2 mL血标本用于检测免疫指标，将另一份2 mL血标本置于抗凝试管中，30 min后以3 000 r/min离心10 min，取上清液保存，用于检测肝肾功能指标。

1.2.2EBV-DNA载量检测 (1)将白色云雾状细胞层放入离心管内离心处理5 min，离心速度设置为12 000 r/min；(2)收集沉淀物加入50 μL的DNA提取液中进行充分混匀，100 ℃处理10 min，在离心后取上清液储存备用；(3)接着进行PCR扩增反应。按以下顺序：待测标本、阴性质控品、临界阳性质控品、阳性质控品、定量参考品，吸取2 μL液体置入上样孔中。反应程序：93 ℃ 2 min，93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，总共循环10次；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，循环30次；反应结束后对数据进行保存，再对荧光值进行调节并读取结果，以记录仪自动分析待测标本的病毒拷贝数，并保证阴性质控品不出现数值。

1.2.3免疫指标检测 采用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群，主要指标包括CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、并计算CD4+/CD8+；采用免疫比浊法测定免疫球蛋白(Ig)G、IgA、IgM水平，相关试剂盒购自浙江爱康生物科技有限公司，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4肝肾功能指标检测 采用德国西门子ADVIA 2400型全自动生化分析仪(购自北京泰林东方商贸有限公司)及配套试剂盒检测肝肾功能指标。肝功能指标包括：丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)。肾功能指标包括：血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、尿酸(UA)，具体操作按照试剂盒说明书进行。

2 结 果

2.1各组免疫指标水平比较 从对照组、低载量组、中载量组到高载量组，CD3+T细胞、CD8+T细胞、IgM水平逐渐升高(P<0.05)，而CD4+T细胞、CD4+/CD8+、IgA水平逐渐降低(P<0.05)；低载量组、中载量组、高载量组的IgG水平均高于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 各组免疫指标水平比较

2.2各组肝肾功能指标比较 从对照组、低载量组、中载量组到高载量组，ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA水平依次升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组肝肾功能指标比较

2.3EBV-DNA载量与患儿免疫及肝肾功能指标的相关性 EBV感染患儿EBV-DNA载量与CD3+T细胞、CD8+T细胞、IgM、IgG、ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA均呈正相关(P<0.05)，与CD4+T细胞、CD4+/CD8+、IgA均呈负相关(P<0.05)。见表3。

表3 EBV-DNA载量与患儿免疫及肝肾功能指标的相关性

续表3 EBV-DNA载量与患儿免疫及肝肾功能指标的相关性

2.4EBV-DNA载量对患儿肝肾功能异常和免疫状态的诊断价值 EBV-DNA载量对患儿免疫状态异常预测的曲线下面积(AUC)为0.849(95%CI0.687～0.891)，灵敏度为85.46%，特异度为82.53%；对患儿肝功能异常预测的AUC为0.754(95%CI0.611～0.878)，灵敏度为82.20%，特异度为80.37%；对患儿肾功能异常预测的AUC为0.701(95%CI0.572～0.763)，灵敏度为79.24%，特异度为80.02%。见图1。

图1 EBV-DNA载量对患儿肝肾功能异常和免疫状态的预测价值的ROC曲线

3 讨 论

EBV又称之为人类疱疹病毒4型，亦是首个进入人类视野中和肿瘤密切相关的病毒，全球范围内约有95%左右的人群血清EBV阳性[7-8]。EBV-DNA载量检测是目前临床上用以诊断EBV感染较为理想的方式。相关研究表明，EBV会引发传染性单核细胞增多症，从而使得患者外周血异型淋巴细胞数增加，而儿童因呼吸系统及免疫功能尚未完全成熟，一旦感染EBV则会引发外周血淋巴细胞的异常改变[9-11]。EBV感染后病毒会产生不同的抗原，而此类抗原对应产生的抗体则会发挥不同程度的免疫保护功能[12-14]。另有相关研究证实，临床上约有80%左右的原发性急性EBV感染患儿会出现肝功能损伤[15-16]，且随着近年来相关研究的逐渐深入，在原发性急性EBV感染患儿中发现肾功能也存在损伤，值得临床重点关注。

本研究结果发现，从对照组、低载量组、中载量组到高载量组，CD3+T细胞、CD8+T细胞、IgM水平逐渐升高，而CD4+T细胞、CD4+/CD8+、IgA水平逐渐降低(P<0.05)；低载量组、中载量组、高载量组的IgG水平均高于对照组(P<0.05)，提示EBV感染患儿机体免疫功能受损。相关性研究结果显示，EBV感染患儿EBV-DNA载量与机体免疫状态存在一定的相关性(P<0.05)。表明随着EBV感染患儿的EBV-DNA载量增加，其机体免疫功能随之下降。马颖等[17]研究也指出EBV感染会引起儿童T淋巴细胞免疫机能的异常。分析原因，笔者认为处在EBV裂解期与潜伏期抗原的特异性毒T淋巴细胞大量增殖并凋亡，仅少量的抗原特异性记忆T细胞隐藏在体内，在血液中不断循环，当EBV再次增殖时，记忆T细胞会快速进入活化状态，继而产生更为快速、明显的免疫应答，同时EBV感染会刺激B淋巴细胞分泌Ig，促使体液免疫反应的发生。EBV-DNA载量的增加在一定程度上反映了病毒复制更为活跃，患儿对EBV的抵抗能力更为低下[18]。ALT、AST主要存在于肝脏、心脏组织细胞中，当相应细胞受损时，细胞膜通透性增加，胞质内的ALT、AST释放入血，导致血ALT、AST水平升高；肝脏对TBil的代谢起着重要作用，TBil水平可较好地反映肝功能；BUN、Scr、UA是临床上评估肾功能的常用指标[19]。本研究结果显示，从对照组、低载量组、中载量组到高载量组，ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA水平依次升高(P<0.05)，提示EBV感染患儿存在肝肾功能下降的情况，随着EBV-DNA载量的升高，患儿肝肾功能下降越明显。其中主要原因可能在于EBV-DNA载量的增加预示着病毒复制能力提高，继而增加了肝肾功能异常的发生概率[20]。相关性分析结果显示，EBV感染患儿EBV-DNA载量与CD3+T细胞、CD8+T细胞、IgM、IgG、ALT、AST、TBil、BUN、Scr、UA均呈正相关(P<0.05)，与CD4+T细胞、CD4+/CD8+、IgA均呈负相关(P<0.05)，进一步证实EBV-DNA载量与患儿的免疫功能、肝肾功能相关，EBV-DNA载量升高通过诱导T淋巴细胞大量增殖，以及引起间质性肾炎、IgA缺乏症、肾病综合征等疾病导致患儿肝肾功能下降。此外，本研究发现DNA载量对EBV感染患儿免疫状态异常预测的AUC、灵敏度及特异度最高，而对肾功能损伤的预测价值相对最低，原因可能是因为患儿机体在发生EBV感染后，其免疫系统的有关功能被逐渐激活，而EBV-DNA载量升高往往直接预示着机体内原本平衡的免疫状态被打破，因此更易预测患儿的免疫状态异常。而肝脏具有较好的解毒作用，其可分泌出C-反应蛋白等时相反应蛋白间接地参与机体内的免疫炎性反应，因此DNA载量对肝功能损伤也存在一定的预测价值。而预测肾功能损伤的效果相对较弱的原因主要可能在于患儿的肾脏在遭受EBV感染后尿素氮及24 h蛋白尿等指标水平变化更为明显。这也从侧面反映了随着EBV-DNA载量的增加及免疫功能的下降，EBV感染患儿肝肾功能损伤发生风险随之升高。提示了在实际临床工作中应予以患儿积极有效的抗病毒治疗及增强其免疫功能，继而达到预防肝肾功能损伤的目的。

综上所述，EBV感染患儿EBV-DNA载量和机体免疫状态及肝肾功能损伤密切相关，随着EBV-DNA载量的逐渐增加，机体免疫功能及肝肾功能下降，EBV-DNA载量可作为预测EBV感染患儿免疫功能及肝肾功能的有效指标，具有一定临床应用价值。