刘 朋，杨鸫祥，于冬冬，王秀婷

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨量降低、骨组织微结构破坏，致使骨脆性增加，易发生骨折为特点的全身性骨骼疾病［1］。据统计，全世界60 岁以上人群中，超过2 亿女性患有OP，且每年约有900 多万人因为OP 导致骨折［2］。OP 发病机制较为复杂，与年龄、性别及生活方式等密切相关。目前对于OP 发病机制的研究主要集中在细胞分化与凋亡、成骨/破骨相关信号通路和基因多态性等方面［3］。西医治疗主要采用骨吸收抑制剂、骨形成促进剂及骨矿化药物等，许多药物副反应和药物间的相互影响较多，如长期应用激素类药物可增加乳腺癌及心血管事件的发生风险［4］。因此，对于OP 的临床治疗与管理方案有待进一步优化。

根据OP 的临床表现，可将其归属于中医“骨痿”、“骨痹”、“骨枯”等范畴。《素问·痿论篇》提到“肾主身之骨髓……肾气热，则腰脊不举，骨枯而髓减，发为骨痿”；《灵枢·经脉》曰：“足少阴气绝，则骨枯”。因此OP 的发病机制与肾精亏虚密切相关。龟鹿二仙胶原载于明代王三才所著的《医便》，方中人参大补元气、枸杞子补肾益精，鹿、龟二胶既能补气生精、滋肾阴、壮肾阳，又能补后天脾胃以助“气血生化之源”，全方共奏补肾填精、益气壮骨之功效。齐鹏坤等［5］采用龟鹿二仙汤合阿仑膦酸钠治疗绝经后骨质疏松症，治疗6 个月后患者骨密度及腰背疼痛VAS 评分均明显改善，且效果优于单纯西药治疗。王欣燕等［6］研究发现龟鹿二仙胶可以提高患者血清骨硬化素水平并降低血清β 胶联降解产物、骨钙素和总I 型原胶原N 端前肽水平，从而减少骨吸收并提高骨骼质量。

网络药理学最早是由Hop-kins 提出的研究方法，该方法首先通过公共数据库及文献检索，结合生物信息学技术筛选出已知药物成分及特定疾病的靶点信息，然后利用网络可视化工具构建“活性成分-靶点-通路-疾病“的网络模型，最后通过多层次分析找出活性成分与疾病相关联的关键节点，从而预测药物防治疾病的药理学机制［7］，体现了中药复方”多成分、多靶点、多途径“的特点，符合中医药对疾病本质的认识。本研究采用网络药理学的研究方法，探讨龟鹿二仙胶治疗OP 可能的作用靶点及相关信号通路，以期对龟鹿二仙胶的临床应用及OP 的后续研究提供相应的思路及依据。

1 资料与方法

1.1 龟鹿二仙胶化合物及活性成分筛选

利用中药系统药理学技术平台（TCMSP，http：//tcmspw. com/tcmsp. php）、ETCM 数据库（http：//www.tcmip.cn/）、化学专业数据库（http：//www.organchem.csdb.cn/）和DrugBank 数据库（https：//www.drugbank.ca/）检索龟鹿二仙胶中龟甲胶、鹿角胶、人参、枸杞子所含有的化合物。其中人参、枸杞子含有的化合物在TCMSP 数据库中检索，龟甲胶、鹿角胶含有的化合物在TCMSP 中检索不到，故在ETCM 数据库、化学专业数据库和Drug-Bank 数据库中检索。依据药物ADME（absorption，distribution，metabolism，excretion）特性，以口服生物利用度（oralbioavailability，OB）和类药性（druglikeness，DL）作为筛选指标，筛选阈值为OB≥30%，DL≥0.18，筛选出符合条件的活性成分，龟甲胶和鹿角胶含有的化合物虽然不符合ADME 筛选标准，但通过查阅文献发现，龟甲中含有能促进MSCs 向成骨细胞分化的化合物［8］，鹿角胶中含有多种氨基酸，有能促进钙吸收及骨矿化的化合物［9］，因此将这些化合物作为龟甲胶和鹿角胶的活性成分纳入进行分析。

1.2 龟鹿二仙胶潜在靶点和OP 相关疾病靶点的筛选

基于TCMSP 数据库，将龟甲胶、鹿角胶、人参、枸杞子的活性成分逐一配对潜在靶点，利用Uniprot数据库中UniprotKB 搜索功能（http：//www.uniprot.org/）输入蛋白名称并限定物种为“human”，将检索得到的所有蛋白校正为其官方名称，即为活性成分的预测作用靶点。

OP 已知治疗靶点获取以“osteoporosis”为关键词分别从OMIM（https：//www.omim.org/）和Genecards（https：//www.genecards.org/）数据库中检索，所得靶点即为OP 已知治疗靶点。

1.3 龟鹿二仙胶活性成分靶点与OP 相关治疗靶点相互作用网络

将得到的龟鹿二仙胶的活性成分基因和OP 疾病基因结果输入在线韦恩图平台（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）获得交集基因和韦恩图，并利用Cytoscape3.8.0 软件构建可视化图片。 利用STRING 平台（https：//string-db.rog/），将OP 的已知治疗靶点映射到龟鹿二仙胶活性成分的靶点上，物种选择Homosapiens，隐藏游离蛋白，构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（proteinproteininteraction，PPI），并下载PPI 蛋白互作关系图，筛选前30 个PPI 网络核心基因，构建柱状图。

1.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析

采用R 4.0.2 的Bioconductor 生物学数据包进行基因GO 功能和KEGG 通路富集分析，据统计学意义，设置P值为0.05，q 值为0.05 进行GO 生物学富集分析和KEGG 通路富集分析，输出结果并绘制barplot 柱状图和气泡图，最后分析结果讨论龟鹿二仙胶对于OP 的治疗机制。

2 结果

2.1 龟鹿二仙胶化合物、活性成分及潜在靶点的收集与筛选

利用TCMSP 数据库按照OB≥30%，DL≥0.18 的标准进行筛选，获得人参22 个活性成分，枸杞子45 个活性成分，龟甲胶15 个活性成分，鹿角胶14 个活性成分，全方共得到活性化合物96 个，剔除重复成分后剩余87 个活性成分。基于TCMSP 数据库将活性成分逐一与潜在靶点配对，剔除无靶点活性成分，最后人参748 个靶点，枸杞子1 202 个靶点，龟甲胶-鹿角胶761 个靶点，全方共2 711 个靶点。通过Uniprot 数据库将靶点名校正为官方名称并剔除重复，最终龟鹿二仙胶共有87 个活性成分，2 305 个靶点。

2.2 骨质疏松症的已知疾病靶点筛选

从OMIM，Genecards 数据库中共检索到4 278个OP 有关的已知治疗靶点，删除重复项后共4 141个靶点。

2.3 龟鹿二仙胶活性成分靶点与骨质疏松症靶点交集基因

将龟鹿二仙胶活性成分靶点与OP 的靶点基因导入Excel 中获得龟鹿二仙胶-骨质疏松症的共同靶点，利用在线韦恩图平台绘制韦恩图，记录共同靶点所对应的骨质疏松症关键化合物，剔除无关化合物。最终得到与龟鹿二仙胶-骨质疏松症相关化合物50 个，共同靶点71 个。见表1、图1。

图1 龟鹿二仙胶－骨质疏松症交集基因韦恩图Fig 1 Venny map of Guilu Erxian Gum-osteoporosis intersection gene

表1 龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症交集基因Tab 1 Intersection gene of Guilu Erxian Gum in the treatment of osteoporosis

2.4 龟鹿二仙胶-骨质疏松症靶点可视化网络构建

将获得的交集基因导入Cytoscape3.8.0 软件中，构建龟鹿二仙胶-骨质疏松症可视化网络（图2），网络中共123 个节点（71 个基因，50 个关键化合物，1 个疾病名称，1 个药物名称），其中红色矩形表明50 种关键活性成分，活性成分括甾体类、黄酮类等。蓝色菱形代表71 个交集基因。根据节点度数进行排序，排名前四位的化学成分分别是：槲皮素quercetin（54）、β-谷甾醇beta-sitosterol（11）、甘氨酸glycine（11）、豆甾醇Stigmasterol（9），排名前四位的靶点分别是PGR、PTGS1、NCOA2、GABRA1。

图2 龟鹿二仙胶-骨质疏松症可视化网络Fig 2 Guilu Erxian Gum-osteoporosis visualization network

2.5 PPI 网络构建

将获得的71 个交集基因输入STRING 软件中得到图3，其中每个节点代表相关蛋白，每条边代表蛋白与蛋白相互作用关系，其边数数量与相关蛋白核心程度呈正相关，选取排名靠前的30 个蛋白构建柱状图（图4），前30 个蛋白名称分别为：ALB、IL-6、VEGFA、CASP3、MAPK8、EGFR、ESR1、MYC、CCND1、FOS、AR、CTNNB1、ERBB2、PPARG、RELA、CASP8、AHR、NOS3、PGR、HIF1A、ICAM1、CASP9、CAV1、CCNB1、ESR2、RB1、VCAM1、PARP1、HSPB1、NFKBIA。这些蛋白对于骨质疏松症的治疗起关键作用。

图3 龟鹿二仙胶－骨质疏松症蛋白相互作用核心网络Fig 3 Core net work of interaction between Guilu Erxian Gum and osteoporosis protein

图4 核心蛋白柱状图Fig 4 Core protein histogram

2.6 GO 富集分析

龟鹿二仙胶治疗OP 核心靶点基因的GO 功能富集分析结果见图5。龟鹿二仙胶治疗OP 的核心靶点基因的GO 功能主要涉及核受体活性、配体激活转录因子活性、DNA 结合转录因子结合、RNA 聚合酶Ⅱ特异性DNA 结合转录因子结合、DNA 结合转录激活物活性、类固醇激素受体结合、核激素受体结合、雌激素受体结合等。

图5 龟鹿二仙胶活性成分治疗骨质疏松症关键靶点的GO 生物学过程富集分析barplot 柱状图Fig 5 Barplot histogram of GO richment analysis of key targets of Guilu Erxian Gum in the treatment of osteoporosis

2.7 KEGG 通路富集分析

龟鹿二仙胶治疗OP 核心靶点基因的KEGG 通路富集分析结果见图6，龟鹿二仙胶治疗OP 的核心靶点基因的KEGG 功能主要涉及：TNF 信号通路、细胞凋亡信号通路、IL-17 信号通路、内分泌抵抗、p53 信号通路、NF-κB 信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、Toll 样受体信号通路、C 型凝集素受体信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、破骨细胞分化、VEGF 信号通路等，按照P值由大到小进行排序，选取前15 条关键通路得到表2。

表2 龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的关键信号通路Tab 2 Key signaling pathways of Guilu Erxian Gum in the treatment of osteoporosis

图6 龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症关键靶点富集信号通路barplot 柱状图Fig 6 Barplot histogram of signaling pathway of key target enrichment of Guilu Erxian Gum in the treatment of osteoporosis

3 讨论

OP 的发病是以肾精亏虚为根本［10］。龟鹿二仙胶是补肾的经典方药，具有补肾填精、益气壮骨之功效，对于改善骨代谢、提高骨密度具有重要作用［11］。药理研究表明［12］，龟鹿二仙胶含药血清对骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及向成骨细胞分化具有明显促进作用。龟甲、鹿角胶中含有的胶原蛋白、多肽及氨基酸等多种化学成分物具有显著的强骨作用［13-15］。但目前尚缺乏龟鹿二仙胶治疗OP 的相关实验研究，故运用网络药理学进行初步探讨。

本研究共筛选出龟鹿二仙胶治疗OP 的活性成分50 个，关键靶点71 个。经“药物-活性成分-疾病-靶点”网络分析可知，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇及甘氨酸等可能是龟鹿二仙胶治疗OP 的关键活性成分。既往实验表明［16］，槲皮素能够通过上调BMP2和Smad4 表达从而促进成骨分化，发挥抗OP 的治疗作用。除此之外，体外实验［17］也证明槲皮素能促进BMSCs 的增殖及成骨分化，增加碱性磷酸酶（ALP）活性和矿化结节数目；β-谷甾醇可通过刺激卵巢颗粒细胞分泌雌二醇并升高成骨细胞骨保护因子（OPG）与破骨细胞分化因子比值，从而加强成骨作用［18］；鹿骨粉中甘氨酸等多种氨基酸成分可以提升OP 大鼠骨密度，改善尿钙/尿肌酐比值及血清ALP 水平［19］。对于豆甾醇，可能是龟鹿二仙胶治疗OP 的一种重要有效成分，目前暂无相关实验研究，有待进一步验证。

本研究表明，龟鹿二仙胶的主要有效成分可通过多个靶点基因影响OP 的发病。龟鹿二仙胶治疗OP 的核心靶点基因主要有血清白蛋白（ALB）、白介素-6（IL-6）、VEGFA、胱冬酶3（CASP3）、促分裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）等，这些基因可通过介导骨吸收和骨形成来调控OP 的发生。目前认为营养不良是OP 发病的重要危险因素［20］，而ALB 是衡量机体营养状况的重要指标，临床及实验研究显示［21，22］，血清中ALB 水平减低与骨密度下降呈明显正相关，提示了低ALB 水平与OP 的发病密切相关。胱冬酶3（CASP3）是细胞线粒体凋亡通路中的关键蛋白，正常情况下以非活化的形式存在，当细胞凋亡程序启动时，CASP3 在蛋白水解酶的作用下被激活并与下游蛋白发生级联反应，使凋亡发生［23］，因此调节成骨细胞和破骨细胞凋亡是许多中药治疗OP 的重要作用机制［24］。IL-6 与OP 的发病密切相关，血清IL-6 的升高是OP 发病的重要危险因素［25］，IL-6 能促进成骨细胞释放IL-1、前列腺素E2等下游信号分子，降低OPG 表达并升高RANKL表达，从而促进破骨细胞形成，增强骨吸收活动［26］。徐俊［27］报道称，防风多糖能够通过调节细胞因子，降低去势大鼠血清IL-6、肿瘤坏死因子-α 水平，从而减少OP 大鼠的骨吸收。血管内皮生长因子A（VEGFA）是VEGF 家族中诱导血管生成、增加血管通透性的关键细胞因子，也是传统意义上的VEGF。研究发现［28］，正常健康人群体内VEGF 表达较OP 人群中高的多，提示了其在维持骨代谢中有重要的作用。MAPK8 是MAPKs 家族的重要成员之一，其可通过磷酸化并活化激活蛋白-1，从而活化下游基因的表达，在细胞增殖、分化、存亡过程中起着重要调节作用［29］，目前研究发现其主要与癌症的发病密切相关，但是针对MAPK8 在骨代谢方面研究较少。因此，需要进一步的研究来证实MAPK8 在OP 发病及治疗中的潜在作用。

龟鹿二仙胶治疗OP 的核心靶点基因的KEGG通路众多，通过上述通路分析可知，龟鹿二仙胶治疗OP 的相关途径主要涉及：（1）调节炎性因子：研究发现［30］，Th17 细胞可以分泌IL-17，IL-22 等炎性因子，促进破骨细胞形成，加速骨吸收。IL-17 可通过上调组织蛋白酶k、基质金属蛋白酶9 的表达，强化破骨细胞降解骨基质的能力［31］。刘金勇等［32］观察龟鹿补骨方治疗绝经后骨质疏松症临床疗效，并探究其对Th17/Treg 细胞因子的影响，实验结果表明，龟鹿补骨方可以通过逆转Th17/Treg 失衡、降低IL-17，IL-22 等促炎因子，从而减少骨量丢失，提高骨密度。（2）调节成骨/破骨细胞分化：PI3K/Akt信号通路与骨代谢关系密切，是调控骨骼组成细胞的重要通路［33］。研究发现［34］，应用LY294002 靶向抑制PI3K，可以明显减少破骨细胞分化数量，并下调p38MAPK 通路中的原癌基因（c-fos）蛋白和基因表达水平，从而降低破骨细胞吸收功能；NF-κB 信号通路对成骨和破骨细胞分化、成熟有着重要调控作用［35］。研究发现［36］，通过敲除小鼠NF-κB1 和NF-κB2 基因可以使破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化的能力明显减弱，同时抑制破骨相关因子抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、降钙素受体等表达。张玉卓等［37］发现，龟甲水提取液可以明显促进MC3T3-E1 向成骨细胞分化，并降低分化过程中NF-κBp65、NF-κBp105 和IL-6 的表达，提示其促进成骨分化机制与抑制NF-κB 信号通路及降低炎症反应有关；研究发现［38］，去势小鼠破骨细胞中HIF-1α 水平及骨吸收指标CTX-1 升高，通过HIF-1α 抑制剂干预后可以可以明显逆转这一情况，说明OP的发生与HIF-1 信号通路密切相关，抑制该通路可以起到抗OP 的治疗作用。（3）改善微循环：VEGF具有很强的诱导血管生成的能力，是调节血管-成骨耦联的重要细胞因子，其一方面可以可以直接促进成骨活动并减少骨吸收，另一方面还通过与VEGFR-2 及VEGFR-1 相互协同来调节内皮细胞活动，促进骨内血管网生成，从而改善骨代谢，增加骨密度［39］。王晓燕等［40］研究发现，大鼠去势后骨髓微循环灌注及血管内皮标志物CD31、VEGF 表达明显减低，通过青娥丸干预后可有效改善这一情况，证明了青娥丸可通过改善骨髓内微循环治疗OP。（4）促进破骨细胞凋亡：于冬冬等［41］研究发现，鹿角胶丸能通过促进AKT 磷酸化、调节Bcl-2-Bax 复合体、增加Caspase-3 裂解，从而促进破骨细胞凋亡，且该作用机制能被PI3K/Akt 通路抑制剂所逆转，提示鹿角胶丸促进破骨细胞凋亡与PI3-K/Akt 信号通路密切相关。

综上所述，龟鹿二仙胶主要通过抑制炎症反应、调控成骨/破骨细胞分化、改善骨内微循环、促进破骨细胞凋亡等途径调节骨代谢，从而治疗OP。龟鹿二仙胶生物网络复杂庞大，本研究通过构建“活性成分-靶标”网络对龟鹿二仙胶的核心活性成分以及作用靶标进行了预测，并进行生物信息学的数据分析，预测龟鹿二仙胶治疗OP 的相关机制，引证现有研究结果，为后续的龟鹿二仙胶药理机制研究提供了新的思路。