ImageJ在骨细胞陷窝特性3D呈现中的应用
2018-01-17王冰倩吕正涛
王冰倩 吕正涛
[摘要] 骨细胞的三维（3D）形态可以顺应机械应力发生改变，同时骨细胞陷窝形态的变化也可以影响骨细胞作为骨主要机械传感器的功能。因此揭示皮质骨中骨细胞陷窝的3D形态特征对于在细胞水平下更好地了解其机械性质结构是至关重要的。本文笔者基于实验室的仪器（3D X射线显微镜，MicroXCT-200）拍摄的100幅连续图像，提出了一种高效的使用ImageJ软件对骨细胞陷窝的3D特征进行量化的图像分析方法。通过对图像序列的导入、阈值分割、降噪处理、反转、填充以及逻辑运算等处理步骤，最终得到感兴趣区域内骨细胞陷窝的数量、表面积、体积以及其他用于描绘骨细胞3D特征的指数。
[关键词] ImageJ；骨细胞陷窝；3D形态；皮质骨
[中图分类号] R336 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）10（c）-0172-06
[Abstract] The three-dimensional （3D） morphology of osteocytes is assumed to adapt to physiological mechanical loading， the variation in the morphology of osteocyte lacunae is hypothesized to influence the function of osteocytes as the master mechanosensors of bone. Thus， to reveal the 3D characterization of osteocyte lacunae in cortical bone is essential for a better understanding of its structure in relation to its inferior mechanical properties in a cellular level. In this paper， the authors used a series of 100 consecutive images from laboratory-based instrumentation （3D X-ray microscope， MicroXCT-200） and proposed a computationally efficient image analysis method to quantify the 3D characterization of osteocyte lacunae using ImageJ software. The number of osteocyte lacunae （N.Lc）， surface area of osteocyte lacunae （Lc.SA）， volume of osteocyte lacunae （Lc.V） and other parameters used to describe 3D characterization of osteocyte lacunae within the region of interest could be accomplished after a series of operations including importing the image stack， thresholding and despeckling， inverting， filling holes and logical calculation.
[Key words] ImageJ； Osteocyte lacunae； 3D morphology； Cortical bone
骨細胞陷窝（osteocyte lacunae）在松质骨和皮质骨组织中均大量存在，成年人类骨组织中估计有420亿骨细胞陷窝[1]。正由于其数量庞大，轻微的数量上的变动都可能使骨组织的机械特性产生极大的改变[2-7]。骨细胞陷窝数量减少会导致骨组织孔隙率降低，所以当骨组织遭遇机械应力时其吸收机械应力的能力也会随之下降，骨折风险随之上升[8-12]。
由于骨细胞及其陷窝不像成骨细胞或破骨细胞那样在骨的表面发挥生物学功能，骨细胞及陷窝是内嵌在骨基质当中，所以迄今为止用来直接观测骨细胞陷窝形态的方法并不多[4，13]。而且单个骨细胞陷窝体积很小，一小块骨组织也包含成千上万的骨细胞陷窝，所以分析骨细胞的分布和形态不仅极其费时，更多地也是停留在二维方法，比如共聚焦显微镜[14]、扫描电镜[15]、透射电镜等[16]。CT及μCT等三维扫描技术越来越多地被应用在骨细胞形态学研究中[17-19]，然而三维扫描之后的图像序列通常大小超过1 GB，现存的用于三维重建的软件比如Avizo、Amira等均需要购买昂贵的证书，而且对于电脑中央处理器和显卡要求很高，这极大提高了骨组织样本分析的难度和成本。
ImageJ是由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）开发的一款基于Java语言平台的免费图像处理软件，大量的免费插件也极大的拓宽了ImageJ的使用范围。ImageJ在医学影像诊断领域应用广泛，而国内医学数据库现存文献中有关如何开发或使用ImageJ的资料相对匮乏，尚未有文献报道如何使用ImageJ软件分析骨细胞陷窝形态的资料。因此本文旨在总结如何使用ImageJ对骨组织扫描的图像序列进行三维重建并分析骨细胞陷窝形态学特征，建立一种利用ImageJ分析骨细胞陷窝三维特征的流程框架，为将来研究骨细胞形态学的研究提供技术基础。
1 ImageJ下载及安装
ImageJ软件的下载地址为：https：//imagej.nih.gov/ij/download.html，对应不同的系统平台选择不同的ImageJ安装包进行下载。截至2018年5月，最新的ImageJ版本为ImageJ 1.8.0版本。为了处理骨细胞陷窝特征数据还需要下载ImageJ的BoneJ插件[20]（http：//bonej.org/）。本文所使用的ImageJ软件为基于Windows 10系统的1.8.0最新版本，BoneJ插件为1.4.2版本。
2 骨细胞陷窝特性的测量过程
2.1 导入图像序列及图像属性设置
ImageJ软件可以支持TIFF、PNG、BMP、DICOM、GIP、JEPG等多种图片格式的输入。在三维重建之前，首先需要在ImageJ导入一组图像序列，使用File> Import> Image Sequence命令将100张连续的DICOM图像序列导入ImageJ。本文使用的图像序列为8周龄野生型雄性C57BL/6小鼠的胫骨骨干内侧皮质经过MicroXCT-200扫描得到的图像序列，扫描位置详见图1a。成功导入图像序列之后，根据扫描样本的实际大小设置ImageJ中的图像序列参数，以便后期进行骨细胞陷窝体积大小筛选使用。使用Image> Properties命令，设置图像序列的长度单位以及像素长度宽度等参数（图1b），例如本文使用的图像序列为100张连续的434.12 μm×445.61 μm大小的图像。
2.2 阈值分割及降噪处理
阈值分割是利用灰度直方图分析图像序列的灰度分布，从而实现将图像上的像素标记为背景或对象，从而实现对图像序列的二值化。使用Image> Adjust> Threshold命令，在阈值分割时使用ImageJ自带的“Default”算法，点击Apply以后将骨细胞陷窝标记为白色，其余部分为黑色（图2a）。此时图像序列已转化为二值化的图像序列，但是图像序列中可见有类似胡椒盐形状的背景噪声，为了更好地呈现骨细胞陷窝形态并同时减少电脑的运算负担，需要将图像序列进行降噪处理。在ImageJ提供的多种过滤器中，可以选择Median 3D或Mean 3D过滤器对图像序列进行降噪处理，Median 3D相比于Mean 3D对图像边缘的保留效果更好，使用Process > Filters > Median 3D命令，得到降噪之后的图像见图2b。
2.3 反转及填充
在阈值分割和降噪处理之后可以得到更加清晰的二值化图像序列（图2b），骨细胞陷窝标记为白色，骨基质为黑色，外周背景为白色。将图像序列反转之后得到骨细胞陷窝为黑色，骨基质为白色，其余背景均为黑色（图3a）。此时打开图2b，使用Process> Binary> Fill Holes命令，将图2b中的骨细胞陷窝填充成黑色从而得到图3b。此时将图2b进行填充的目的是为了进行下一步的逻辑运算，以便得到骨細胞陷窝的图像序列。
2.4 逻辑运算及感兴趣区域的创建
为了得到骨细胞陷窝，笔者在这里使用ImageJ提供的“AND”逻辑运算功能。由于图3a骨细胞陷窝为黑色，骨基质为白色；而图3b骨基质及骨细胞陷窝均为黑色，所以AND运算之后仅骨细胞陷窝以及之前存留的背景噪声会存留下来（图4a）。ImageJ软件提供了强大的感兴趣区域（region of interest，ROI）的选择功能，在此不做赘述。由于图像序列中有一部分并非骨皮质部分，笔者利用圆形选择工具在图4a的骨皮质范围内选择直径为300.30 μm的圆形为ROI，去除圆圈以外的图像得到图4b。此时的图4b所在区域详见图1a。
2.5 分析骨细胞陷窝特性
分析骨细胞陷窝的特性还需要ImageJ中的Particle Analyser插件。在打开图4b之后，使用Plugins>Analyze > Particle Analyser命令进行分析，此时可以看到如图5的设置页面，其中包括测量选项（Measurement Options）以及图像结果显示选项（Graphical Results）。在测量选项中如果选择了“Exclude on sides”选项则表示图像序列边缘的粒子不会被计入统计，为了避免破碎的骨细胞陷窝干扰最终的统计结果笔者在统计骨细胞陷窝特征时可以排除边缘的骨细胞；其他的测量选项还包括是否测量骨细胞陷窝的表面积（Surface Area）、体积（Enclosed Volume）、Euler特征（Euler Characteristic）、惯性矩（Moments of Inertia）等信息，选择的选项越多，电脑的运算负担也会越重，得到结果的速度就越慢；“Min Volume”和“Max Volume”选项是Particle Analyser的重要过滤器，可以通过限制粒子的体积来过滤图像中的背景噪声，或者是体积过大的血管结构等。
由于在图1b中笔者已经设置了图像序列的真实大小，此时根据客观骨细胞大小，将Min Volume设置为50 μm3而Max Volume设置为1500 μm3，可以得到体积范围在50～1500 μm3的骨细胞陷窝[21]。体积小于50 μm3被认为是背景噪声或伪影，而体积大于1500 μm3被认为是骨基质中的血管或者哈佛管。在图像结果显示中，凡是标记了3D显示的结果，均会在ImageJ的ImageJ D Viewer中显示。而数字统计结果如图6。常见的用于描述骨细胞陷窝大小的指标有骨细胞陷窝数量（N.Lc）、总的骨细胞陷窝体积（Lc.V，μm3）、平均骨细胞陷窝体积（
2.6 图像的3D呈现
除了得到数字运算的结果，ImageJ还具有骨细胞陷窝3D呈现的功能，以便更好地了解骨细胞陷窝的大小及分布情况。笔者以体积呈现（Volume Rendering）为例：打开图6之后，使用Plugins>3D>Volume Viewer命令，会打开一个新的Volume Viewer 2.0操作界面，如图7所示。图7中央显示的是100张连续图像序列中，被选中的感兴趣区域里，体积体积范围在50～1500 μm3的121个骨细胞陷窝的体积呈现。使用鼠标可以对图像序列的边框进行拖动，得到更好的体积呈现效果。
3 小结
ImageJ是NIH开发的基于Java语言的一款公用多维图像处理工具及分析平臺，可运行于Microsoft Windows、Mac OS、Mac OS X、Linux和Sharp Zaurus PDA等多种平台。其开放源代码、免费、支持多种插件应用、兼容多格式图像来源、处理速度快、占用内存小、适用性强等特点，使其在影像学诊断、检验医学等多个医学领域研究分析中应用广泛，但目前尚未有文献报道如何使用ImageJ分析皮质骨中骨细胞陷窝的3D形态特征。
使用ImageJ软件图像处理分析作为一种客观的评价手段，通过设定若干参数，能直接得到准确性高、重复性较好的数据，可几乎不受主观认知和经验等人为因素干扰。本研究使用ImageJ将野生型雄性C57BLI6小鼠胫骨经过MicroXCT-200扫描得到的100张连续图像序列进行阈值分割、降噪处理、反转、孔洞填充、逻辑运算及划定感兴趣区域，逐步得到较准确的骨细胞陷窝的图像序列。进一步使用ImageJ中Particle Analyser等插件，剔除图像中背景噪声、伪影等体积小于50 μm3的颗粒，以及体积大于1500 μm3的血管或者哈佛管，达到净化目标图像的目的。同时可计算、统计得到多类描述骨细胞陷窝大小的指标数值。为更好、更直接地呈现骨细胞陷窝的大小及分布情况，ImageJ可对骨细胞陷窝的3D形态特征进行量化和呈现，得到实验者期望的呈现效果。
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（收稿日期：2018-05-17 本文編辑：苏 畅）
