林珏杉　董伟　徐纯峰　等

[摘要] 目的 研究唑来膦酸（ZOL）对破骨细胞黏附以及整合素αv和β3基因表达的影响。方法 体外诱导小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化，通过抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色及牙本质吸收陷窝检测以评价破骨细胞生成情况。将细胞分为对照组及ZOL处理组两组，后者用1×10-6 mol·L-1的ZOL处理2 d，用结晶紫染色法检测细胞黏附情况，用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot和免疫荧光化学法检测整合素αv、β3 mRNA及蛋白表达水平。结果 TRAP染色及牙本质吸收陷窝检测提示有多核破骨细胞生成。ZOL处理组破骨细胞黏附能力较对照组显著降低（P<0.01）。ZOL处理组整合素αv、β3 mRNA水平分别为0.66±0.05、0.59±0.08，显著低于对照组的1.01±0.01和1.01±0.02（P<0.01）；蛋白表达水平分别为31 934.84±112.91、18 812.79±194.13， 较对照组（52 517.81±211.72、

31 441.93±456.87）分別下降了39.19%和40.17%（P<0.01）。免疫荧光化学检测显示，ZOL处理使整合素αv、β3荧光强度（9.491±0.748、4.744±0.759）较对照组（15.159±1.143、11.418±1.095）分别降低了37.39% 和58.45%（P<0.01）。结论 ZOL可抑制破骨细胞黏附并下调整合素αv、β3表达；ZOL的上述作用可能参与对破骨细胞性骨吸收的抑制。

[关键词] 唑来膦酸； 破骨细胞； 细胞黏附； 整合素αv和β3； 封闭区

[中图分类号] Q 26 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.004

3 讨论

整合素是细胞表面重要的黏附受体，是由α、β两个亚基组成的异源二聚体，参与细胞与基质、细胞与细胞间的接触[2]。破骨细胞表面主要表达整合素αv和β3，通过与骨桥蛋白、骨涎蛋白、玻连蛋白等骨基质蛋白内的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列结合，调控破骨细胞的黏附、迁移、封闭区形成及骨吸收[5]。

研究[2，6]表明，许多信号分子参与了整合素αv、β3介导的信号调控。整合素αv、β3与骨基质蛋白中RGD序列结合，从而使细胞质与其结合的c-Src活化，并与适配蛋白脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）形成复合体。Syk通过SH2功能域与破骨细胞表面DNAX活化蛋白12（DNAX-activating protein 12，Dap12）的免疫酪氨酸活化基序（immu-noreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）功能域结合。活化的c-Src使Syk磷酸化，进而激活下游信号分子SLP-76（含有SH2结构域的相对分子质量为7.6×104的白细胞蛋白）和鸟嘌呤转换因子Vav3，使无活性的Rac转变成活性Rac，从与二磷酸鸟苷（gua-nosine diphosphate，GDP）结合转变成与三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）结合；从而诱发破骨细胞的细胞骨架重排形成肌动蛋白环。整合素αv、β3分布于肌动蛋白环的内侧和外侧，形成封闭区，为骨吸收提供所需的微环境。

整合素αv、β3功能改变会对破骨细胞黏附、细胞骨架重排及封闭区形成产生重要影响。整合素β3基因敲除小鼠表现出明显的骨量增加，这与破骨细胞介导的骨吸收障碍有关[7]。即使在RANKL和巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factors，M-CSF）作用下，整合素β3-/-破骨细胞也不能形成肌动蛋白环，骨吸收活性明显下降[8]；整合素β3点突变会使破骨细胞迁移能力显著降低[9]。双膦酸盐作为破骨细胞的有效抑制药物，能否通过影响整合素αv、β3来发挥对破骨细胞的抑制作用，目前尚不清楚。在本研究中，应用RANKL诱导RAW263.7细胞向破骨细胞分化，同时用1×10-6 mol·L-1 ZOL处理；发现ZOL处理组整合素αv、β3 mRNA水平较对照组明显下降，蛋白水平也分别下降了39.19%和40.17%；免疫荧光检测也表明，ZOL组整合素αv、β3荧光强度显著降低，分别下降了37.39%和58.45%。上述结果提示，ZOL可显著抑制破骨细胞中整合素αv、β3基因表达，从而影响αv、β3在破骨细胞黏附、细胞骨架重排及骨吸收中的作用。结晶紫染色实验进一步表明，ZOL处理组OD值显著低于对照组，证实了ZOL对破骨细胞黏附的抑制作用。国外学者[10]应用人成骨细胞作为研究对象，发现ZOL同样可抑制细胞黏附及整合素αv、β3基因的表达。研究[11]发现，接受双膦酸盐长期治疗的患者体内存在巨大的破骨细胞，不能贴附于骨组织表面，这也可能与双膦酸盐对破骨细胞表面整合素αv、β3的抑制有关。

研究整合素在破骨细胞功能中的作用有极其重要的价值。破骨细胞在骨质疏松、多发性骨髓瘤、骨转移瘤等多种病理性骨吸收中发挥着重要作用[1]；而其进行骨吸收的前提是通过整合素αv、β3与骨基质表面发生黏附，使细胞骨架重排，形成封闭区和皱褶缘，为骨吸收提供局部微环境[2， 5-6]。临床前研究表明，整合素αv、β3靶向药物，如多肽（S247、ATN-

161、cilengitide）及非肽类小分子（PSK1404），均可有效抑制骨吸收及肿瘤骨转移[12-13]；从而为以整合素αv、β3为靶向进行药物干预，抑制上述病理状态下的骨吸收开辟了新途径。

本研究表明，在体外ZOL可有效地抑制破骨细胞整合素αv、β3的基因表达，降低细胞的黏附能力；ZOL的上述作用可能与其对破骨细胞性骨吸收的抑制有关。

[参考文献]

[1] Edwards JR， Weivoda MM. Osteoclasts： malefactors of disease and targets for treatment[J]. Discov Med， 2012， 13

（70）：201-210.

[2] Izawa T， Zou W， Chappel JC， et al. c-Src links a RANK/αvβ3 integrin complex to the osteoclast cytoskeleton[J]. Mol Cell Biol， 2012， 32（14）：2943-2953.

[3] Piper PK Jr， Gruntmanis U. Management of osteoporosis in the aging male： focus on zoledronic acid[J]. Clin Interv Aging， 2009， 4：289-303.

[4] 刘强， 董伟， 戚孟春， 等. 阿仑膦酸盐对破骨细胞生成的抑制及钙离子激动剂的拮抗效应[J]. 实用口腔医学杂志， 2012， 28（2）：182-186.

[5] Szabo AM， Howell NR， Pellegrini P， et al. Development and validation of competition binding assays for affinity to the extracellular matrix receptors， αvβ3 and αIIbβ3 integrin[J]. Anal Biochem， 2012， 423（1）：70-77.

[6] Teitelbaum SL. The osteoclast and its unique cytoskeleton

[J]. Ann N Y Acad Sci， 2011， 1240：14-17.

[7] McHugh KP， Hodivala-Dilke K， Zheng MH， et al. Mice lacking beta 3 integrins are osteosclerotic because of dys-functional osteoclasts[J]. J Clin Invest， 2000， 105（4）：433-

440.

[8] Feng X， Novack DV， Faccio R， et al. A Glanzmanns mu-tation in beta 3 integrin specifically impairs osteoclast func-tion[J]. J Clin Invest， 2001， 107（9）：1137-1144.

[9] Faccio R， Novack DV， Zallone A， et al. Dynamic changes in the osteoclast cytoskeleton in response to growth factors and cell attachment are controlled by beta 3 integrin[J]. J Cell Biol， 2003， 162（3）：499-509.

[10] Koch FP， Wunsch A， Merkel C， et al. The influence of bis-phosphonates on human osteoblast migration and integrin avb3/tenascin C gene expression in vitro[J]. Head Face Med， 2011， 7（1）：4.

[11] Weinstein RS， Roberson PK， Manolagas SC. Giant osteoc-last formation and long-term oral bisphosphonate therapy

[J]. N Engl J Med， 2009， 360（1）：53-62.

[12] Clézardin P. Therapeutic targets for bone metastases in breast cancer[J]. Breast Cancer Res， 2011， 13（2）：207.

[13] Cl?zardin P. Integrins in bone metastasis formation and po-tential therapeutic implications[J]. Curr Cancer Drug Targets， 2009， 9（7）：801-806.

（本文采編 石冰）