李明浩 杨佳璇 李艾静 朱自严 叶璐夷

RH血型系统的D抗原是免疫原性最强、最具多态性、最复杂的红细胞血型抗原之一，在临床输血中具有重要的临床意义。D抗原由RHD基因编码的RhD蛋白携带，单克隆抗体已确定至少有30种抗原表位[1]。RhD蛋白由位于1号染色体短臂的RHD基因编码，其跨红细胞膜12次，N末端和C末端位于膜内并形成6个膜外结构域[2]。

除常见的D阳性和D阴性表型外，还存在D变异型，包括弱D、部分D和DEL等。通常认为，弱D表型表现为D抗原表达的减弱，部分D表型表现为D抗原表位的改变。但是两者的界限并不明确，仅利用血清学无法区分，目前基因测序是鉴定D变异型较好的方法。RHD-CE-D基因融合、胞外环单个氨基酸或多个氨基酸位点突变[3]都会导致D抗原表位缺失或影响胞外环的3D构象，表现为部分D。部分D表型个体因缺失了某些D抗原表位，在接受正常RhD阳性血液时可产生针对所缺表位的抗体，继而导致严重的输血反应；而部分D表型献血者的血液制品输注给D阴性个体也有一定的几率产生抗-D抗体。因此，部分D表型新RHD基因突变的发现对于预测输血或妊娠中抗-D同种异体免疫的潜在风险有重要的意义。

我们通过对1例D变异型献血者样本开展血清学及基因水平研究，发现其RHD基因存在c.492C＞G位点突变，从而导致RhD蛋白第3个胞外环编码氨基酸天冬氨酸被谷氨酸替代，表现为部分D表型。该突变类型目前国际上仅发现1例，国内属首次报道。对于RHD基因合子型的检测，过去曾报道过的方法包括传统的RFLP-PCR[4]，实时定量PCR[5]以及最新的定量技术数字PCR[6]等。本研究采用最近发展起来的数字PCR技术应用于RHD基因合子型的检测，相对于实时定量PCR方法提高了精确度。

材料与方法

1 标本来源 血液样本来自1例上海市血液中心无偿献血者，初筛为RhD阴性，ABO血型为A。随机已知RHD基因型DNA样本来自本实验室保存。该样本相关项目已通过上海市血液中心医学伦理审查委员会审批（编号：SBC-IRB-2019-19）。

2 方法

2.1 检测试剂：单克隆IgM/IgG抗-D 试剂（均购自上海血液生物医药公司；IgM抗-D，克隆号Rum-1；IgG抗-D，克隆号MS-26）；IgG抗-D为2种不同来源的多克隆人源抗-D血清；单克隆IgM抗-C、抗-c、抗-E、抗-e（均购自上海血液生物医药公司；抗-C，克隆号MS-24；抗-c，克隆号MS-33；抗-E，克隆号MS-80+258；抗-e，克隆号MS-16+21+63）；血液基因组DNA提取试剂盒（购自天根生化科技有限公司；货号DP304）；抗原表位检测试剂盒（D-screen，Diagast，法国，克隆号P3×P3×61+21223B10+P3+P3×290×35）；实时定量PCR扩增预混液（购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；货号11184ES08）；数字PCR相关试剂（购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；货号1863023）。

2.2 血清学检测：对该样本采用试管法进行CE分型、Rh阴性确认和D抗原表位检测。按照D-screen试剂盒说明书方法检测样本的D抗原表位。

2.3RHD基因测序：根据天根生物血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取外周血白膜细胞的基因组DNA。根据参考文献[7-8]中的引物及扩增方法，对RHD基因1号至10号外显子，包括相邻的侧翼内含子区域，进行PCR扩增并送测。PCR扩增仪为ABI Veriti。引物合成及测序均送至上海生工生物完成。

2.4RHD杂合性分析：采用伯乐生物数字PCR探针法试剂盒，严格按照说明书将探针法预混反应液、DNA模板、引物及探针配置成20 μL的PCR反应体系，并利用微滴生成仪（伯乐，QX200）将混合的PCR反应液分散成微滴，每个微滴作为单独体系进行PCR扩增，并利用微滴读取仪（伯乐，QX200）逐滴读取，实现对目标基因的绝对定量。PCR扩增反应程序为：预变性95℃ 10 min；变性94℃ 30 s，退火延伸60℃ 1 min，共40个循环；酶灭活98℃ 10 min。严格按照扩增方法检测RHD基因的5号、7号外显子并将β-ACTIN作为内参基因，PCR扩增引物及探针根据参考文献设计[9-10]。采用数字PCR方法分析该新突变样本的RHD杂合型。同时对26例随机已知基因型样本分别通过数字PCR和实时定量PCR方法扩增RHD基因5、7号外显子及β-ACTIN基因，并比较合子型的准确性及结果的离散程度。实时定量PCR仪器为罗氏LightCycler480Ⅱ，严格按照扩增方法检测RHD基因的5号、7号外显子及内参基因β-ACTIN，扩增引物根据参考文献设计[9-11]，反应程序为：预变性95℃ 5 min；变性95℃10 s，退火延伸60℃ 30 s，共40个循环。

2.5 蛋白3D模型的建立：利用Robetta同源建模网站（http：//www.robetta.org/），将部分D型和野生型RhD蛋白的氨基酸序列导入网站，分别构建部分D型和野生型RhD蛋白3D构象模型。

结 果

1 血清学结果 本研究的该名献血者样本在Rh阴性确认实验中与单克隆IgM抗-D抗体反应为阴性，与1种单克隆抗-D抗体、2种多克隆抗-D抗体反应均为3+。CE分型为CcEe，详见表1。

表1 样本血清学分型

2 RhD抗原表位分析 使用D-Screen试剂盒分析该样本D抗原表位分布，样本红细胞与针对D抗原的epD9.1、epD5.4、epD2.1和epD3.1表位的单克隆抗-D反应呈阳性（分别为2+s、2+、2+和3+），与其他单克隆抗-D反应均为阴性，表现为部分D表型，结果见表2。

表2 D抗原表位检测

3 Sanger测序分析 对该个体RHD基因1号至10号外显子及相邻侧翼内含子区域扩增并测序。测序结果显示RHD基因第4号外显子存在c.492C＞G突变，测序结果见图1。该突变导致RhD蛋白第3个胞外环上164位氨基酸天冬氨酸被谷氨酸替换（p.Asp164Glu）[12]。4 构建数字PCR检测RHD基因型的方法 利用数字PCR和实时定量PCR分别对随机RHD纯合、杂合样本检测RHD基因5、7号外显子及内参基因β-ACTIN的相对表达。

图1 RHD基因测序结果

实时定量PCR检测RHD基因的相对表达，其中12个纯合样本相对值在0.7～1.5之间，14个杂合样本在0.2～0.8之间。数字PCR方法检测RHD基因拷贝数，相对于内参基因β-ACTIN，12个纯合样本得到的比值范围是0.9～1.1，14个杂合样本则为0.46～0.56。其中数字PCR的结果为RHD/β-ACTIN（FAM/HEX）拷贝数的比例，实时定量PCR为2-△△CT的结果。详见图2。

对实时定量PCR和数字PCR的统计结果进行差异显著性分析。统计结果显示，相比于实时定量PCR，数字PCR同组样本间的重复性较好，结果更稳定，纯合组和杂合组数据的差异显著，详见图2A-D。同时分析几组数据的变异系数（CV），发现数字PCR结果的CV值明显低于实时定量PCR，提示数字PCR可以更精准、稳定地进行RHD基因杂合性分析，结果见图2E。

图2 实时定量PCR与数字PCR检测RHD基因相对表达及统计学分析

5RHD杂合性分析 利用数字PCR检测该例D变异型样本RHD基因5、7号外显子DNA水平的表达，结果显示RHD基因5、7号外显子的拷贝数约为内参基因β-ACTIN的一半，提示该样本RHD基因型为杂合，结果见图3和表3。

表3 数字PCR检测RHD杂合性

图3 数字PCR检测RHD基因的相对表达

6 RhD抗原蛋白建模 从3D结构模型可以看出，部分D型与野生型RhD蛋白在第3个胞外环存在螺旋构象的改变，提示p.Asp164Glu突变影响了蛋白的螺旋结构，可能导致D抗原epD6.6、epD6.4、epD6.1、epD5.4和epD8.2表位的缺失，结果见图4。

图4 野生型及突变型RhD蛋白的3D结构比较

讨 论

RhD蛋白编码基因RHD突变导致其胞外环改变是产生部分D表型的主要原因。目前已经发现超过80种部分D等位基因，大部分来自欧洲及非洲血统[13]。曾有研究显示，中国人群中部分D的占比约为0.003%[14]，是稀有的血型。

本研究中的样本来自1名无偿志愿献血者，初筛为RhD阴性，D阴性确认结果为D变异型。利用Sanger测序检测发现其RHD基因4号外显子存在c.492C＞G突变，为错义突变，编码氨基酸天冬氨酸被谷氨酸替换。天冬氨酸和谷氨酸均为酸性氨基酸，但等电点略有差异，这种突变是否影响对应抗原表达，还需要进一步研究证实。

本研究为国内首次上报该位点突变部分D表型的血清学结果。针对RHD*492G位点突变目前国际上仅澳大利亚研究人员报道过1例个体。LOPEZ[15]等人通过测序及抗原表位分析，2017年首次上报基因库，登录序列号为KY614793，但已报道的携带RHD*492G位点突变的1例部分D个体表型与本例突变样本缺失的抗原表位不同，样本红细胞与针对D抗原的epD8.1、epD5.1、epD6.3、epD1.1、epD4.1、epD9.1、epD6.6和epD6.3表位的单克隆抗-D反应呈强阳性4+，epD3.1、epD1.2表位的单克隆抗-D反应呈阳性（分别为3+和2+），仅epD1.2表位单克隆抗-D反应为阴性。抗原表位缺失差异的原因尚不明确，但因两例个体的人群背景不同，提示可能存在个体差异。同时，已报道样本CE分型为Ccee，而本研究为CcEe，是否有关需进一步研究。此外，荷兰研究人员STEGMANN等人报道过1例c.492C＞A的错义突变（RHD*61）[12]，RHD*61位点突变虽然也会导致编码氨基酸天冬氨酸被谷氨酸替代，导致部分D表型，但其与本例及已报道RHD*492G位点突变的血清学结果不同。该研究报道的抗原表位，除D抗原epD5、epD8.2表位缺失外，样本红细胞与针对D抗原的epD1、epD2、epD3、epD6、epD7、epD8和epD9表位的单克隆抗-D反应均呈强阳性或阳性（4+或3+），与针对D抗原的多克隆抗-D反应呈阳性（3+）。

实时定量PCR[16]和数字PCR[6]技术均可用于RHD基因型检测，本课题组曾采用实时定量PCR检测RHD基因合子型用以补充RFLP方法可能产生的误判[17]。数字PCR是基因表达的定量检测技术，近年发展起来用于检测RHD基因合子型，其相对于实时定量PCR，可以更准确地进行基因分型。本研究中利用数字PCR和实时定量PCR技术对随机样本的合子型进行分析比较。RHD基因与内参基因β-ACTIN相对定量结果显示，数字PCR技术在灵敏度和基因分型的准确性上更具优势。此外，组内数据的离散程度显示，变异系数（CV值）在数字PCR得到的结果中显著低于实时定量PCR，说明其结果重现性更高、更稳定、更精确，可以大大地降低因结果离散导致的误判。通过数字PCR技术，进一步分析该个体RHD基因合子型，确认其基因型为杂合RHD基因，提示RHD基因的1条等位基因携带c.492C＞G突变，1条等位基因缺失。

本研究的不足之处在于，由于该例携带新突变的部分D个体为献血者，缺乏D抗原同种免疫相关的临床证据，因此其临床意义还需进一步探讨。同时，本研究与国外报道均显示该突变虽然导致D抗原表位的部分缺失，但D抗原强度较强。如采用的单克隆抗-D鉴定试剂不当，误判为D阴性并输注给阴性受血者，可能会产生同种抗体，继而引起溶血性输血反应。

综上所述，本研究发现1例部分D表型献血者其RHD等位基因为国内首次报道，并分析其D抗原表位及表型产生可能的分子机制。部分D个体存在抗-D同种异体免疫的高风险[18]，因此，准确鉴定基因型可为其输血安全提供准确的依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突