朱自严

免疫血液学的宗旨是预判本次输血是成功的，而其最终的目标是尽可能地避免有害的输血反应，但是输血并非是一项完全可控的治疗。临床上在ABO和RhD血型抗原匹配的情况下，输血仍然可能会发生免疫应答并产生血型同种抗体。血型同种抗体一旦形成，IgG分子可破坏与其结合的红细胞（RBC），最常见的是通过调理性吞噬，即血管外清除，但在某些情况下是通过补体介导的血管内破坏。因此，如果患者对RBC抗原产生了应答，那么随后的输血可能与大量不良事件有关。困难不仅在于RBC的破坏抵消了输血的任何治疗益处，更重要的是在于清除RBC所产生的下游效应可能会导致众多的不良后果，如多器官衰竭、电解质紊乱、凝血障碍，甚至导致死亡。此外，如果多次输血，患者可能会产生多种血型同种抗体，从而使找到配合的供者变得越来越困难。

在过去的几十年中，通过分析人类血液，在蛋白质和核酸水平上定义和表征人类RBC和血小板血型抗原已取得了巨大进展。但这些分析几乎都集中在同种抗原及其同源抗体的分子性质上。受限于当前实验技术的局限性，目前在对患者是否会在输血后产生抗体或患者细胞免疫调节相关机制的研究还未取得实质性进展。

1 血型抗原的免疫原性 对血型抗原同种免疫进行人体研究是一件十分困难的事。因为每个个体的RBC上通常只携带345种血型抗原[1]的一部分，因此对于受血者而言，仅输注1个单位的供者RBC后，机体也会面对许多外来抗原的挑战。这些外来抗原中有些与受血者自身RBC上表达的抗原仅仅是单一氨基酸的不同（例如，E对e），而有些对受血者来说则是完全外来的（例如，Rh阴性的受血者遇到Rh阳性RBC）。一些血型抗原是由蛋白组成的，而另一些则是糖基决定簇。有些抗原仅在RBC上表达（如Rh，Kell），而另一些抗原也在器官或组织上表达（如ABH、Lewis）。在极少数情况下，患者可能会在身体其他部位表达血型抗原，但在RBC上不表达，如黑人中发现的GATA-box沉默突变导致的Fyb阴性。这些Fyb阴性的个体在输入Fyb阳性的RBC后，是不会产生抗Fyb抗体的[2]。由于一些器官上也表达血型抗原，因此同种抗体不仅在输血或妊娠中具有临床相关性，在移植中也具有临床意义。例如，如果有抗Jk抗体的患者移植了Jk抗原阳性的肾脏，移植效果会受到影响[3]。

抗原的免疫原性，也可以理解为当抗原阴性个体暴露于抗原阳性条件下，产生免疫反应的可能性有多大。在输血中，血型抗原的免疫原性可以通过将阳性抗原输给阴性受体，然后测量产生抗体的百分比来确定。这是1960年Giblett在第13届AABB年会上提出的，也被称为Giblett方程，被用于评估种内输血血型抗原的免疫能力，即：

其中x=群体中鉴定出的针对目标抗原的抗体数量；fK=群体中K抗原的频率；0.05=K抗原的免疫力；K=群体中鉴定出的抗K抗体数量；fx=群体中x抗原的频率；（fK）×（1-fK）和（fx）×（1-fx）分别代表了抗原阴性的人暴露于抗原K和x的概率。2009年耶鲁大学的TORMEY在该方程中引入了一个校正参数（抗体的持续时间）对方程进行了修正[4]，经过修订后，TORMEY对临床上部分血型抗原的免疫原性再次进行了由强到弱的排序，除了D抗原之外，其他血型抗原的免疫原性是K＞Jk（a）＞Lu（a）＞E＞P1＞c＞M＞Le（b）＞C＞Le（a）＞Fy（a）＞S[5]。但是评估血型抗原的免疫能力依然是一项费力的工作，因为抗体产生的时间和数量，以及抗体持续的时间都存在变化。而我们所测得的同种抗体，常常还包括了天然产生的抗体（如抗Lewis、抗M、抗N、抗P1）和免疫产生的两种抗体。但天然产生的抗体并不是输血诱导的，而在免疫产生的抗体中又包含了输血诱导和妊娠诱导，虽然这两种都是免疫产生的，但机体对这两种免疫方式的应答机制有较大的不同。因此之前大多数对抗原免疫原性的计算都根据其发生频率而进行粗略的估算。较为精确的血型抗原免疫原性的计算，需首先排除天然抗体的干扰，并以男性受血者为研究对象。

虽然RBC膜上的某种血型抗原拷贝数越多，并不意味着其免疫能力越强，但是当RBC血型抗原的拷贝数变得极低时，免疫原性就会大大降低。不同Rh阳性的个体，由于其RBC上D抗原的拷贝数不同，免疫能力也可完全不同。正常Rh阳性个体RBC上D抗原的表达量在50 000～100 000拷贝，可造成约50%的Rh阴性受血者产生免疫应答。然而，有许多变异的RhD 表型，它们与正常RhD抗原氨基酸序列相同，但拷贝数却少得多；如不同类型的弱D，其RBC上D抗原的拷贝数从60～5 200，其中D抗原拷贝数最少的是弱D17，只有60个，RhD阴性受血者被弱D同种免疫的报道也极少。由于位于每个个体RBC上的血型抗原种类众多，而每种血型抗原的结构可以完全不同，这使得我们很难将RBC同种免疫中抗原密度差异的影响与抗原本身的特性区分开来。为了解决这个问题，Emory大学的研究团队通过小鼠模型生成了在不同水平上稳定表达同一种抗原的RBC，k抗原正常表达和k抗原弱表达。他们发现暴露于具有正常k表达水平的RBC会诱导出强烈的免疫反应并产生IgM和IgG抗体，但如果用k弱表达的RBC去免疫相同的小鼠，则无法诱导RBC同种抗体[6]。当然，这些暴露于低抗原密度RBC的小鼠也并非没有后果，因为受体小鼠随后产生了抗原特异性的耐受。其他常见的Rh抗原在不同表型的RBC上抗原的拷贝数也存在差异，CDe/CDe RBC上的C抗原拷贝数约为45 700～56 400，而Cde/cde RBC上的C抗原拷贝数只有7 200。在临床上人们通常使用具有最高抗原拷贝数的RBC来确定受者所产生的抗体效价。

2 受体的遗传背景对应答的影响 暴露于非自身血型抗原是受体产生同种抗体的必要条件。然而，单独的暴露不足以导致同种免疫，否则每个输血接受者都会被高度同种免疫。同种抗体的产生还受到遗传和环境因素的影响。在ABO血型系统中，由于机体可不通过输血或妊娠而规律性地存在IgM抗A和/或抗B，因此可以判断该应答与T细胞无关。然而更多的具有临床意义的血型抗原的同种免疫是T细胞依赖性的。抗原提呈细胞将特定抗原肽呈递给CD4+T细胞受体，B细胞在滤泡辅助性T细胞和共刺激分子的作用下分泌IgG抗体[7]。而受血者HLA上呈递特定RBC抗原的能力，则是激活T细胞的必要条件。先前的研究显示，携带有HLA-DRB1*04和HLA-DRB1*15:01的个体较易产生抗Fya，携带有HLA-DRB1*01的个体较易产生抗Jka，而HLA-DRB1*07：01的个体较容易产生抗Dia。对于这些特定的RBC抗原，在具有特定MHC Ⅱ类表型的个体中，血型同种抗体的形成似乎得到了增强。在荷兰的一项基于人群的研究表明，携带HLADRB1*15的受血者可能更容易产生一种以上的RBC和HLA血型同种抗体[8]。

尽管同种免疫的遗传易感性可能非常重要，但是受体免疫调节基因中也存在许多遗传变异，理论上可能会影响RBC同种免疫反应。有研究者发现，与β血红蛋白S邻近的Ro52基因rs660C/T的多态性是镰状细胞病中同种免疫效率的标志物[9]。而CD81中的rs708564和rs2237863多态性与同种免疫的强度有很强的关联，也可能作为RBC同种免疫的预测因子[10]。在RBC同种抗体应答者和无应答者中进行全基因组关联的研究较少，并且迄今为止并未发现有大效应的应答者基因座。

3 脾脏中特定免疫细胞对应答的影响 特定解剖位置中免疫细胞的数量，对血型同种免疫反应也会造成影响。已经进行了一些动物研究，这些研究表明边缘区B细胞对于RBC同种免疫至关重要。使用HOD转基因小鼠模型（其红细胞上表达HEL鸡卵溶菌酶、OVA卵清蛋白、人类Duffy血型蛋白三种外源性蛋白），StoweⅡ研究组在探索可能控制早期同种抗体形成的起始免疫因子时发现，输血后HOD RBC持续定位于脾脏的边缘窦，并与边缘区MZB细胞共定位。如果缺乏MZB细胞，抗HOD的IgM和IgG抗体都会被抑制，而如果缺乏CD4+T细胞，则仅仅阻止了IgG抗HOD抗体的产生[11]。如果需要持续地产生抗体，CD4+T细胞的帮助通常是需要的。在脾脏中的树突状细胞（DC）是如何将RBC抗原呈递给幼稚T细胞，这对RBC同种免疫至关重要。脾脏中有两个主要的常规DC细胞亚群（cDCs），根据个体发育的差异被称为cDC1（XCR1+）和cDC2（33D1+）。尽管两个DC亚群都吞噬输注的RBC并在体外激活RBC特异性CD4+T细胞，但体内RBC同种免疫只需要33D1+DC[12]。

4 微生物感染对血型同种免疫的影响 在相同的免疫环境和HLA背景下，输注相同不配合的血型抗原后，有些患者可产生同种血型抗体，而大多数人并不产生同种免疫，因此我们对影响同种免疫的因素目前只是部分确定。在人类ABO血型系统中，我们的免疫系统可通过肠道菌群的刺激，规律性地产生针对非自身ABO抗原的同种抗体。这些由微生物作为免疫原刺激机体产生针对微生物的抗体对人类A和B血型抗原也有交叉反应性。但是，在ABO血型系统之外，其他血型很少能不通过输血或妊娠而产生针对血型抗原的同种抗体。在早期的文献报道中，有因链球菌感染而导致败血症的患者血液中发现类似K抗原物质吸附在RBC上，同样也有报道革兰氏阳性菌可与抗Jkb抗体产生较弱的交叉反应。而日本在一项研究中对18 944名20岁以下的受血者在输血前后进行了同种抗体筛查，发现77%的同种抗M是在1～5岁的婴幼儿中产生，而这些所测到的抗M有66%是发生在输血前。在这项研究中，临床上疑似病毒/细菌感染的患者中发现了至少5例抗M[13]。据报道，感染流感嗜血杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌和脑膜炎双球菌的幼儿几乎都会产生抗M。一些病毒（例如流感病毒、轮状病毒、腺病毒）和细菌会利用唾液酸结构作为结合受体或分泌神经氨酸酶，该酶可修饰血型糖蛋白A（携带MN血型抗原）上的聚糖，从而改变其免疫原性。受感染的宿主对入侵病原体的免疫反应，造成了所谓的“天然产生”并可与微生物有交叉反应的抗M。

2010年ZIMRING研究团队筛选出了针对Kell（K/k），Duffy（Fya/Fyb）和Kidd（Jka/Jkb）三组血型抗原具有同源性序列的微生物，他们从流感嗜血杆菌、弧菌、脆弱拟杆菌、霍乱弧菌、鼠疫杆菌和肠道沙门氏菌中都鉴定出了多个8～9个氨基酸短肽与K/k、Fya/Fyb以及Jka/Jkb抗原有高度同源性。他们通过小鼠模型证明，以前从未接触过人类血型抗原肽刺激的小鼠，如果预先暴露于具有共享表位的病毒或细菌，这些小鼠当首次进行RBC免疫时，T细胞是有反应的[14]。B细胞受体（BCR）所识别的抗原决定簇和CD4+T细胞所识别的抗原决定簇有着根本的不同。抗体识别的是天然的三维结构，而T细胞所识别的是MHCⅡ呈递的线性肽。如果免疫系统在没有天然抗体靶标的情况下遇到线性T细胞表位，那么这仅仅是在CD4+T细胞区室中产生免疫，并可产生辅助性或记忆性CD4+T细胞，但不产生可检测的抗体反应。输血后，包含相同短肽的血型抗原作为“第二次暴露”，RBC上具有三维结构的血型抗原接触B细胞（BCR），在微生物感染所预先形成的辅助性或记忆性CD4+T细胞的帮助下，B细胞被激活并最终分化为浆细胞，分泌针对血型抗原的抗体。因此，如果患者事先暴露于与人类RBC抗原有相同或相似序列的微生物，通过共享CD4+T细胞表位，可激活T细胞，但并不会产生抗体。所以，先前与具有血型抗原同源性序列的微生物接触可能会影响未来机体对RBC输注的反应。这是一件值得注意的事，因为在病毒暴露后，但在RBC输血之前，目前在临床血库中完成的RBC抗体筛查是无法测到这种先前的T细胞“启动”的。然而，BAINE[15]使用BLASTp同源性数据库，查找并比对RBC血型抗原与微生物表位氨基酸一级序列的同源性程度，试图证明之前的假设，即通过环境或感染途径接触微生物肽，机体将对这些RBC抗原模拟物启动初始免疫，这将使患者在输血时接触真正的RBC抗原时，更容易形成强烈的继发性“回忆”体液反应。但是，他们发现与高免疫原性的血型抗原对应的微生物同源性抗原种类较少，而能在自然界普遍存在的微生物中找到同源性的血型抗原往往免疫原性并不强。他们推测这可能是长期、低水平接触多种肠道共生菌群的抗原肽会在宿主中诱导免疫耐受状态。

5 非外表多态性对同种免疫的影响 血型抗原是由RBC膜蛋白胞外结构域中的氨基酸多态性定义的。但是血型抗原分子的多态性并不只限于膜外的肽链部分，在穿膜区和膜内也可具有多态性。这种在穿膜区和膜内的多态性被称为非外表多态性（NEP）。尽管NEP不产生血清学可检测的RBC表面抗原，但如果受体MHCⅡ类分子能够呈递含有NEP的肽，则NEP仍会产生新的CD4+T细胞表位。这在RhD同种免疫中已得到了证实，CD4+T细胞识别的许多优势表位是位于RhD的穿膜或胞内结构域中，而在Duffy血型中，胞内第一环和第二次穿膜区中也存在NEP（C265T→Arg89Cys）[16],（G298A→Ala100Thr）[17]。G298A和C265T都不改变RBC表面Duffy分子的构象，只是导致了Duffy血型分子表达降低。虽然这些在膜内的NEP并不会直接诱导B细胞产生，它们构成了四个潜在的T细胞表位。与识别天然抗原的B细胞不同，CD4+Th细胞（识别肽/MHCⅡ复合物）的肽表位只需要与B细胞上BCR识别的B细胞表位有物理连接就可刺激T细胞，这也被称为CD4+T细胞与B细胞应答的连锁识别。小鼠实验证实，即便这个NEP 并不在抗体的识别区域，这种NEP也能作为CD4+T细胞表位，帮助B细胞识别血清学定义的血型抗原。当前输血实验室常规的检测方法是无法检测到NEP通过增强CD4+Th细胞来促进血型抗原的免疫，其原理与上述微生物中与人类血型同源的肽段通过共享表位预先激活T细胞类似。

将表达NEP的RBC输注到表达不同NEP的受血者时，供体和受体共享相同的RBC表面B细胞表位；根据传统的血清学定义，它们在该基因座的表型是相同的。然而，它们各自表达不同的NEP，构成T细胞表位，并可形成与自身RBC表面B细胞表位相连的外源T细胞表位。尽管机体存在完整的耐受机制，通过胸腺清除自身反应性CD4+Th细胞来阻止自身反应性B细胞的成熟。但是由于受者不表达含有供者的NEP，因此受者不会在胸腺中删除对含供者NEP肽的特异性CD4+Th细胞，所以不会对具有“外来”载体表位的T细胞产生耐受。当外来T细胞表位与自身RBC表面B细胞表位相连时，这种Th细胞可为自身反应性B细胞提供辅助，激活自身反应性B细胞，从而导致自身抗体的形成。基于上述的假说，有学者推测，如果某种人类血型分子中存在多个NEP，并且供体和受体RBC之间不匹配的NEP越多，则同种免疫和自身免疫的可能性就越大[18]。

6 获得性抗体对同种免疫的抑制 输血或怀孕期间由于外来抗原的刺激，机体会产生针对RBC血型抗原的抗体。目前降低同种免疫风险的主要方法是尽可能地在输血前做到更多的血型抗原匹配。但利用抗D免疫球蛋白预防RhD-孕妇在孕期产生抗D，是一个著名的预防RBC同种抗体产生的例子。通过被动获得的抗体抑制了对给定抗原的致敏，该过程称为抗体诱导的免疫抑制（AMIS）。利用该方法，欧美国家对RhD-妇女进行RhIg的预防性治疗成功地从源头防止了与妊娠相关的抗RhD抗体的产生。

与此同时，人们也观察到，在用抗RhD免疫球蛋白治疗特发性血小板减少性紫癜（ITP）时，患者RBC上的D抗原丢失很明显[19]，而在Kell、Kidd，Duffy，Lutheran，LW，Co，Ge，Ena，AnWj和Sc1血型的案例报道中也都有抗原丢失的现象，其中报道次数最多的是Kell抗原的丢失[20]。在免疫血液学实验室的Coomb's检测样本中，大约有10%的自身溶血性贫血（AIHA）患者尽管临床表现为溶血，但直接抗球蛋白实验（DAT）却是阴性的。当然AIHA患者DAT阴性的原因可能是RBC结合抗体的水平低于DAT的检测阈值，或在DAT实验中低亲和力IgG自身抗体被洗脱，也可能标准的Coomb's试剂漏检同种抗体（如IgA、IgG4），但是另有一种可能是RBC通过选择性丢失抗体所识别的抗原，来逃避抗体介导的溶血，即抗原丢失。该现象也在使用抗CD38（DARA）治疗多发性骨髓瘤的患者中发现，由于人的RBC上是表达CD38抗原的，因此理论上采用抗CD38治疗的患者应该会发生溶血现象。通过连续4周对13名采用DARA治疗的患者（对照组24名）监测溶血，DARA治疗组并不引起明显的溶血，经DARA治疗的RBC上CD38下降，而Kell，Duffy血型系统的抗原不变。并且发现DARA诱导的CD38丢失是可逆的，停止治疗或6个月，RBC上CD38的表达可恢复[21]。

尽管了解抗体诱导的免疫机制的最佳方法是研究人类，但这在实践上通常是困难的，并且在伦理上是不可接受的。近20多年来，一些研究者陆续地设计了输血诱导的同种免疫动物模型，这些小鼠模型既可以模拟人类的情况（即同一物种内的输血），也可以着眼于确定的人类RBC血型同种抗原，并且这些抗原具有足够的工具来进行相对复杂的免疫研究。首个在小鼠RBC膜上以跨膜形式被引入的模型血型抗原是鸡蛋溶菌酶（HEL），由悉尼大学、霍华德休斯研究所和斯坦福大学联合制备[22]，第二个被引入的模拟血型抗原是鸡卵清蛋白（OVA），HEL和OVA作为小鼠RBC上引入的血型抗原是因为首先它们是哺乳动物中不存在的蛋白，机体不会对其产生耐受，其次它们是抗原，具有免疫原性。而OVA也常作为免疫学模型蛋白，因为小鼠的MHC Ⅰ和Ⅱ识别该蛋白的哪个肽段已清楚。如最常用的C57BL/6小鼠，其MHC-I识别OVA257-264，MHC-Ⅱ识别OVA323-339，这有利于研究T细胞在应答中的反应。但是，这两个模拟的血型抗原还是过于人工，因此人们随后又在HEL-OVA上，加入了Duffy血型的Fyb抗原，形成了HOD三重融合整合膜蛋白。除HOD之外，目前Kell、GPA也已建立了转基因品系[23-24]。

对于AMIS的机制，不同的学者提出了大约十多种假设，包括快速诱导RBC清除，通过B细胞受体的空间位阻来遮蔽抗原，通过抑制Fcr受体参与来抑制B细胞反应，免疫逃逸与抗原漂移，以及抗体诱导的抗原丢失等等[25-27]。其中抗体诱导的抗原丢失即直接的抗原调控是近几年被推测和检测得最多的一个假说。在用抗Kell和抗HEL分别诱导的HOD x KEL抗原丢失的小鼠模型中[28]，流式显示抗体针对的抗原是随时间而下降的，同时蛋白印迹实验显示抗体针对的蛋白也显著减少，而非抗体针对的抗原不下降。这些实验很好地证明了RBC表面的抗原调节是抗原特异性的，被动免疫受体中输注的HOD x KEL RBC上KEL或HEL抗原水平降低不是由于RBC的非特异性膜改变。但是在非完整摄入RBC的前提下，是哪些因素决定了RBC抗原可以从RBC表面特异性地去除，目前所有的抗体诱导的抗原丢失只发生在体内（体外无法诱导），而能诱导抗原丢失的抗体也只能是多克隆抗体。因此抗体诱导的免疫抑制，其相关机制还未全部阐明。

7 总结 虽然避免血型抗原的同种免疫最确定的方法是避免暴露于同种抗原，输血前尽可能多的抗原匹配肯定是有益的。血清学表型和血型基因检测的高通量技术平台在近几年中都取得了很大进展。但在基层输血实验室使用这些技术还需要加大技术支持，另外必须始终权衡这些方法在实验室操作上和财政上的可行性与实际医疗收益之间的关系。

虽然学术界对于应答者和非应答者的定义还有争议，但是临床经验和数据统计的结果均支持可将受血者分为两组。除了关注同种抗体是如何产生之外，受血者的免疫细胞对同种抗原反应也可能具有明显的作用。对这种细胞应答的潜在后遗症和病理生理学的评估是具有医学意义和研究价值的。进一步促进预防受血者同种免疫的最佳策略是必要的，这些新策略包括在输血前对现有的免疫调节方法进行预试，当然新干预措施的实施很大程度上将取决于对新机制的理解。

利益冲突作者声明不存在利益冲突