彭松林 王尚 王振民 龙灿玲 唐菀泽 贺小琴 陈高扬

骨质疏松症是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征，导致骨脆性增加，易发生骨折的复杂、多因素全身性慢性骨骼疾病，发病人群集中在绝经后女性［1］。随着老龄化现象的加剧，骨质疏松症的发病人数逐年增加，给病人带来了全身骨痛、骨折、身高变矮等痛苦和伤害，同时也给社会和家庭带来了沉重的经济和生活负担［2-3］。因为骨质疏松发生和发展的隐匿性，往往是病人发生骨质疏松骨折后入院治疗才得以发现。因此，骨质疏松的早期筛查和诊断是预防和治疗的关键。骨质疏松症的病理过程受诸如局部和全身激素、遗传调节剂和生活条件等复杂因素的影响［4］。近几年来，作为疾病分子标记物和潜在药物靶点的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的相关研究迅速发展，已有研究表明lncRNA与人类疾病的发生、发展和防治有密切关联，在免疫系统疾病、心血管疾病和肿瘤等疾病中发挥重要作用［5-7］。此外，已有研究报道指出lncRNA参与了成骨细胞的分化［8-10］，说明lncRNA在骨质疏松症中扮演着重要角色。本研究拟从lncRNA层面分析骨质疏松和骨量正常绝经后妇女外周血中lncRNA 的差异表达并检测其在人骨髓间充质干细胞（h-BMSCs）成骨分化过程中的含量变化，探讨其作为诊断骨质疏松分子标志物的可行性。

资料与方法

一、纳入标准与排除标准

纳入标准：①年龄为55～70 岁；②绝经后女性；③无影响骨代谢药物史；④无其他炎性疾病及外伤。

排除标准：①肿瘤；②原发性或继发性甲状旁腺疾病；③肝肾功能异常；④严重心脏疾病；⑤糖尿病；⑥严重胃肠道疾病，如结直肠癌、炎症性肠病、肠易激综合征、长期腹泻、便秘；⑦严重自免疫型疾病，如类风湿性关节炎、红斑狼疮；⑧正在服用皮质类固醇类激素或近3 个月曾服用此类激素；⑨近一个月服用抗生素。

二、研究对象

收集2019年全年在本院体检女性的临床资料，根据双能X射线骨密度扫描结果，选取30例骨密度T值≥-1 SD妇女纳入骨量正常组（30例），30例T值≤-2.5 SD 的妇女为骨质疏松组，建立临床样品库。经病人知情同意后抽取部分外周血，分离其外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）并通过高通量测序检测PBMC中lncRNA的表达。

三、试剂和设备

BD-10mL EDTA 真空管采血管（沈阳宝康生物工程有限公司，中国）；人外周血淋巴细胞分离液（深圳市达科为生物技术股份有限公司，中国）；RNA提取试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，中国）；lncRNA 文库构建和测序（深圳市华大基因，中国）；逆转录试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司，中国）；成骨诱导液（赛业生物科技有限公司，中国）；h-BMSCs 培养基（Gibco，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；核酸检测仪nanodrop2000［赛默飞世尔科技（中国）有限公司，美国］；高速离心机［赛默飞世尔科技（中国）有限公司，美国］；qPCR 仪［伯乐生命医学产品（上海）有限公司，美国］。

四、研究方法

（一）外周血中lncRNA相对表达水平的检测

取骨质疏松组和骨量正常组外周血PBMC，严格按照RNA 提取试剂盒的说明书提取总RNA，nanodrop2000检测RNA 浓度，琼脂糖凝胶检测RNA完整性以及基因组污染情况。利用Qubit2.0 RNA检测试剂盒对Total RNA精确定量，以确定文库构建所加入Total RNA 的量。根据VAHTS TM Stranded mRNA-seq Library Prep Kit for Illumina®试剂盒构建lncRNA 文库并扩增，上机高通量测序分析差异lncRNA。

（二）PCR 检测外周血PBMC 中差异表达lncRNA的相对表达水平

取PBMC 细胞，使用Trizol 提取细胞总RNA，检测其浓度与纯度，将总RNA 反转录为cDNA。反转录条件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃30 min。然后根据实时荧光定量PCR 进行检测，结果以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt相对定量法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

（三）h-BMSCs的培养及成骨诱导

h-BMSCs 购自于ATCC 细胞库，使用的培养基为α-MEM，内含10%胎牛血清与抗生素（青霉素100 U/mL 和链霉素100 μg/mL），于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。h-BMSCs细胞以5×104个/皿接种于六孔板，待细胞铺满板底约60%时（记为成骨诱导第0天），换成骨诱导液培养。成骨诱导开始后每2 d换液，分批次共诱导培养3、7、14 d。换液时弃原成骨诱导液，然后配置新鲜的成骨诱导液，以每孔2.5 mL加入六孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

（四）茜素红染色检测成骨效果

将h-BMSCs接种在24孔板中，分为对照组和成骨诱导组。对照组常规培养基培养，成骨诱导组换成骨诱导液培养14 d 后，4%多聚甲醛固定，按照茜素红染液说明书进行染色操作，检测细胞成骨效果。

（五）qPCR 检测诱导过程中成骨相关基因的表达

将成骨诱导分化过程中的h-BMSCs 细胞（0、3、7、14 d）加入RNA 提取试剂-Trizol。RNA 提取和逆转录方法同研究方法（二），检测成骨相关基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Runt 相关转录因子2（Runx2）、骨钙素（osteocalcin，OCN）及骨桥蛋白（osteopontin，OPN）mRNA 的表达。引物序列见表1。

表1 引物序列信息

（六）qPCR检测差异表达的lncRNA在成骨分化过程中的表达量

提取0、3、7、14 d 的h-BMSCs 细胞的RNA 并按照反转录试剂盒说明书将RNA 反转录为cDNA，最后把其作为模板通过qPCR 检测差异lncRNA 的表达水平，内参基因为GAPDH，上海生工生物工程股份有限公司协助完成引物设计和合成，序列见表1。

五、统计学分析

采用SPSS 20.0（IBM 公司，美国）对数据进行统计分析，正态分布的计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

结 果

一、外周血中lncRNA的差异表达情况

热图显示，与骨量正常组相比，骨质疏松组外周血PBMC 细胞中存在15 个差异表达的lncRNA（P＜0.05）（图1），其中NONHSAT005760.2表达量明显上调（P＜0.01）。

图1 外周血中lncRNA的差异表达情况

二、外周血PBMC 中NONHSAT00-5760.2 的相对表达水平

qPCR检测结果显示，骨质疏松组病人外周血中NONHSAT005760.2 的表达量明显上升（P＜0.05）（图2）。

图2 NONHSAT005760.2在临床病人外周血中的表达

三、茜素红染色结果和成骨相关基因表达

在h-BMSCs 成骨诱导14 d 过程中，成骨相关基因ALP、Runx2、OCN、OPN 的表达均明显上调（图3），同时诱导14 d后茜素红染色结果显示钙沉积明显，基因和形态学结果均表明成骨诱导成功（图4）。

图3 成骨相关基因的表达（与0 d比较，*P＜0.05）

图4 成骨诱导14 d后茜素红染色结果 a：对照组，×40；b：成骨诱导组，×40；c：对照组，×100；d：成骨诱导组，×100

四、NONHSAT005760.2在h-BMSCs成骨分化过程中的表达

qPCR检测结果显示NONHSAT005760.2的表达在h-BMSCs 成骨分化过程中随着时间延长而降低（图5），表明NONHSAT005760.2 的表达与成骨呈负相关。

图5 成骨分化过程中lncRNA NONHSAT005760.2的相对表达情况（与0 d比较，*P＜0.05）

讨 论

随着高通量测序技术的飞速发展，原本被认为是“转录噪音”的lncRNA 逐渐被证实在多种不同的生物学过程中发挥着重要作用。lncRNA 是一类长度超过200 个核苷酸，但不能翻译成蛋白质的RNA分子，其主要作用为信号分子，具有作为生物标记物的潜能，且能调控基因转录。lncRNAs 作为复杂有机体分子生物学的前沿研究领域，有其独特的生物学特性及待开发潜力。lncRNAs 通常比mRNAs 的表达水平低，其表达具有细胞和组织特异性，可用于特定疾病的预测和诊断。越来越多研究发现，lncRNAs几乎参与调控基因表达的每一个阶段［11-13］。

目前研究表明骨质疏松症与遗传、雌激素、营养和生活方式密切相关，主要发病机制是雌激素缺乏导致破骨细胞增殖分化，破骨细胞功能活跃，同时抑制破骨细胞凋亡，从而使骨吸收速度超过骨形成速度，造成骨质有机物和无机物成比例地减少［14］。另外，雌激素受体、维生素D 受体、Ⅰ型胶原和转化因子-β等基因多态性也与骨质疏松关系密切［15］。

目前临床上骨质疏松症病人以绝经后女性居多，其发病隐匿，经常是病人在骨折发生后做手术时才知道患有骨质疏松，因此本研究旨在通过收集绝经后女性外周血样本进行高通量测序，从而寻找骨质疏松相关的早期标志物，以期为临床骨质疏松的早期诊断提供参考。关于非编码RNA 近些年来才展开对其功能的研究［16］，其中lncRNA作为其主要成员之一［7］，在多种疾病中均被发现异常表达，但是其具体是通过何种机制如何发挥功能的，目前还处于一个相对空白的阶段。lncRNA的异常表达，增多或者减少，均提示癌症进展的一些阶段，甚至可以预测早期癌症治疗的疗效［17］。然而，当前骨质疏松症lncRNA的研究主要采用了芯片技术以及qPCR方法，低通量和小样本量进行局部研究。随着二代高通量测序技术的发展，lncRNA测序技术在该领域研究中将有很大的应用前景和技术优势。在骨质疏松领域，目前有报道发现lncRNA 在骨质疏松的发生、发展中也发挥着重要作用［18］。本研究发现NONHSAT005760.2 在骨质疏松绝经后妇女外周血中明显高表达，同时在h-BMSCs成骨分化过程中低表达，表明其与骨质疏松密切相关。可作为预测骨质疏松的指标。提示lncRNA NONHSAT005760.2有希望成为绝经后妇女骨质疏松诊断的分子标志物，为骨质疏松的防治提供了新的思路。但lncRNA NONHSAT005760.2 与骨质疏松症的具体作用通路和下游具体分子机制尚不明确，NONHSAT005760.2 的下游通路和对成骨的具体作用机制是我们下一步研究的重要方向，亟待我们进一步探究。