郑玲 代琪芳 陈雪冬

摘要：bHLH转录因子在植物的生长发育、生物合成及胁迫反应等方面起着重要作用。利用生物信息学方法对森林草莓全基因组序列进行bHLH家族的搜索和鉴定，共鉴定出112个森林草莓的bHLH基因，这些基因分别被定位在7条染色体上，但分布不均匀，在5号染色体上分布得最多，3号染色体上分布得最少。进化树结果显示，森林草莓的bHLH家族可以进一步被分为12个亚家族，其中第Ⅰ、Ⅲ亚族的成员较多。森林草莓bHLH家族基因的表达模式分析结果显示，有73个FvbHLH基因与花的发育相关，有28个FvbHLH基因与果实的发育相关，其中FvbHLH97/36/55/39/42/52/26/44/68/54对森林草莓花的整个发育过程都尤为重要，而FvbHLH57/59/66/78/100/15/17/46则在果实发育中起到主要的调控作用。

关键词：森林草莓;bHLH;进化树;花发育;果实发育

中图分类号： S668.401  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）02-0047-06

收稿日期：2021-03-28

基金项目：河南省高等学校重点科研项目（编号：20A180018）;洛阳师范学院博士科研启动项目（编号：180141051235）。

作者简介：郑 玲（1981—），女，河南南阳人，硕士，副教授，主要从事植物学研究。E-mail：linda2266@qq.com。

转录因子又称为反式作用因子，是一类能够结合在顺式作用元件上调控基因表达的DNA结合蛋白[1]。目前，人们已经从植物中鉴定出很多转录因子，其中bHLH（碱性螺旋-环-螺旋）是第二大类转录因子[2]。bHLH转录因子因含有高度保守的bHLH结构域而被命名，bHLH结构域约含有60个保守氨基酸序列，由basic区域、HLH（helix-loop-helix）区域组成[3]。位于N端的basic区域是 DNA结合的碱性区域，约含有15个氨基酸，其中有6个是碱性氨基酸残基;HLH区域位于C末端，主要由疏水氨基酸组成，并参与形成同源或异源二聚体[4]。

bHLH转录因子在真核生物中最为广泛存在，其功能也具有多样性。在酵母和其他单细胞真核生物中，bHLH参与染色体分离和代谢调控等过程[5]。bHLH转录因子可参与植物的物质合成和信号转导过程[6]，并在植物生长发育[7]及抗旱[8]、耐盐[9]等胁迫应答反应中起着关键作用。植物中最早被发现的bHLH转录因子（即玉米中由R基因编码的Lc蛋白）的主要功能为参与花青素的生物合成[10]。随后，拟南芥的AtbHLH1/2/42、水稻的OsbHLH013/016等基因都被证明与花青素的合成调控有关[11-13]，拟南芥AtbHLH40则与赤霉素的合成转导有关[14]。在响应植物胁迫方面，拟南芥AtbHLH112是盐、干旱及渗透胁迫的正调控因子[15];AtbHLH116基因是耐寒性的调节子，能够提高植物的抗冻能力[16]。在植物生长发育方面，拟南芥的AtbHLH9、AtbHLH65基因均是调控植物生长发育的关键信号枢纽[17];AtbHLH95基因主要在胚乳中表达，控制胚胎发育，从而导致植物生长迟缓[18];拟南芥的AtbHLH21和水稻的OsbHLH164对花粉粒的形成及绒毡层细胞的发育有着关键的调控作用[19-20]。

森林草莓（Fragaria vesca）也称野草莓，是蔷薇科草莓属的多年生草本植物，属于二倍体植物[21]，具有相当高的食用价值和药用价值。目前，国内外在分子生物学方面对拟南芥、水稻等植物bHLH家族的研究已经较为成熟，然而还没有关于森林草莓bHLH转录因子鉴定和分析的报道。本研究利用生物信息学方法对森林草莓bHLH（FvbHLH）家族的成员进行鉴定，并对其理化性质、系统进化、基因在染色体上的分布、基因结构及表达模式等方面进行全面分析，以期为将来深入研究该家族基因的结构和功能提供重要参考。

1 材料与方法

1.1 森林草莓bHLH家族的鉴定

本研究对象是森林草莓（Fragaria vesca）。2020年3—6月在洛阳师范学院生命科学学院生物信息学实验室（214）电脑上进行软件操作和信息处理。森林草莓bHLH家族的蛋白质序列数据来自Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html？）与PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）数据库，由于2个数据库中搜索到的结果会存在差异，因此将2類搜索结果进行序列比对后，手动去除冗余序列，随后利用InterPro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）在线软件鉴定搜索的候选基因是否具有bHLH结构域，进而获得bHLH家族的所有成员。

1.2 森林草莓bHLH家族的理化性质分析

通过在线软件ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）得到森林草莓bHLH蛋白序列的基本理化性质信息，如理论等电点、氨基酸数量、分子量及总水平疏水性等。

1.3 森林草莓bHLH家族系统进化树的构建

从PlantTFDB数据库下载森林草莓和拟南芥的bHLH序列，随后通过MEGA 6.0的Clustal W工具进行多序列比对，将获得的比对结果用MEGA 6.0软件构建系统进化树[22]。同时采用相同方法单独构建森林草莓的bHLH家族进化树。

1.4 森林草莓bHLH基因在染色体上的定位

根据Phytozome数据库中搜索到的FvbHLH基因在染色体上的位置信息，利用MapInspect软件绘制基因在染色体上的分布图[23]。

1.5 森林草莓bHLH基因在花、果实发育过程中的作用分析

从文献[24-25]的附件中分别下载森林草莓花发育、果实发育过程中所有转录因子的表达量，进一步筛选出bHLH基因在各组织中的转录表达量。用MeV4软件分别对检测到的FvbHLH基因表达量进行聚类分析[26]。

2 结果与分析

2.1 森林草莓bHLH家族基因的鉴定及理化特性分析

通过PlantTFDB、Phytozome两大数据库共鉴定出112个候选bHLH家族基因，利用InterPro进行验证，结果显示，这112个基因编码的蛋白质都具有完整的bHLH结构域。同时利用ExPASy在线分析工具得到这112个FvbHLH家族基因编码蛋白的理论等电点、氨基酸数、原子组成及脂溶指数等理化信息。根据基因在染色体上的位置，将这112个转录因子依次命名为FvbHLH1～FvbHLH112。

结果显示，各蛋白质分子中的氨基酸数量在90（FvbHLH64）～1 496（FvbHLH27）个之间，平均为434个;蛋白质分子量在10 296.6 u（FvbHLH64）～166 739.0 u（FvbHLH27）之间，平均为47 959.6 u;理论等电点在4.35（FvbHLH9）～10.94（FvbHLH106）之间，并且有70个蛋白质的等电点在4～7之间，说明森林草莓bHLH家族蛋白的氨基酸序列的等电点大多在酸性范围内。有73个蛋白质分子的不稳定指数均大于50，说明bHLH蛋白质的状态不稳定。对蛋白质的亲疏水性进行分析发现，除FvbHLH76外，其余蛋白质的总水平疏水性均为负值，表明森林草莓bHLH家族蛋白大多属于亲水蛋白。

2.2 森林草莓bHLH家族基因进化树的构建

选取111个拟南芥bHLH家族成员作为参考来构建森林草莓bHLH家族的系统进化树（图1）。根据拟南芥bHLH转录因子的分类系统，可将森林草莓的112个bHLH成员划分为12个亚族。其中第Ⅵ亚族成员最少，只有1个FvbHLH、2个AtbHLH;其次是第Ⅱ亚族，有1个FvbHLH、3个AtbHLH;第Ⅲ亚族的成员数最多，包含19个FvbHLH、17个AtbHLH;第Ⅰ亚族的基因数也较多，有15个FvbHLH、17个AtbHLH。其余亚家族的成员数量不一。

2.3 森林草莓bHLH家族基因在染色体上的定位

利用MapInspect软件绘制出基因在染色体上的分布情况，由图2可以看出，在森林草莓的全部bHLH基因中，FvbHLH104～FvbHLH112尚未定位到染色体上，其余103个基因在7条染色体上均有分布，但分布不均匀。其中5号染色体上分布的基因最多，有22个（FvbHLH55～FvbHLH76）;其次是2、4号染色体，都各有17个基因（FvbHLH12～FvbHLH28和FvbHLH38～FvbHLH54）;3号染色体上分布的基因较少，为9个（FvbHLH29～FvbHLH37），其余染色体上的基因分布数量为11～15个不等。多条染色体上出现了由2个或多个基因聚集在一起形成的基因簇。

2.4 森林草莓bHLH基因在花发育过程中的作用分析

用MeV4软件对检测到的FvbHLH家族成员在花发育过程中相关基因的表达量进行聚类分析。由图3可以看出，在森林草莓的花瓣（flower）、花被（perianth）、花托（receptacle）、花药（anther）及小孢子（micrsopore）、花粉（pollen）和雌蕊（carpel）发育的过程中，共有73个FvbHLH家族基因表达。

结果显示，有10个基因（FvbHLH97/36/55/39/42/52/26/44/68/54）在所有组织中的表达量均较高。FvbHLH90/19/9/107/80/67/22/1/11/18/15/51/24/46这14个基因除了在花粉中不表达之外，在其余组织中均大量表达。同样的，FvbHLH57/93/37/43/78/71也仅在小孢子、花粉中的表达量较低。此外，有些基因的表达模式显示出组织特异性，例如FvbHLH53在花药、花粉和雌蕊中高表达;FvbHLH13在小孢子、花药中高表达;FvbHLH86在雌蕊、花药中高表达;FvbHLH89/34在花药、花粉中高表达;FvbHLH16只在花粉中大量表达;FvbHLH12/4只在花药发育过程中的表达水平较高;FvbHLH10/

112/88/63/29只在雌蕊中高表达。

2.5 森林草莓bHLH家族基因在果实发育过程中的作用分析

通过MeV4软件对检测到的FvbHLH家族成员在果实发育过程中相关基因的表达量进行聚类分析。由图4可以看出，共有28个FvbHLH家族基因在森林草莓胚胎（embryo）、胚珠（ovule）、种皮（ghost）、种子（seed）及子房壁（wall）、果皮（cortex）、木髓（pith）的发育过程中表达。

研究发现，在胚珠、种子和子房壁发育的过程中，有14个基因即FvbHLH90/96/58/40/57/91/16/66/78/100/81/15/17/46均显示出高表达，其中FvbHLH96/57/91/16/66/78/100/81/15/17/46在种皮整个发育阶段中的表达量也很高，还有部分基因的表达水平则在种皮的不同发育阶段存在较大差异，例如FvbHLH10/91/33的表达量持续增加，而FvbHLH58/66/15的表达量却逐漸减少。在果皮、木髓中，FvbHLH77/57/59/112/99/66/78/100/79/64/30/15/17/46共14个基因的表达水平都很高，有些基因则只在这2种组织的特定发育阶段表达，例如FvbHLH90、FvbHLH84分别只在果皮、木髓发育的 1～2阶段显示出较高的表达量，FvbHLH72只在果皮发育的4～5阶段高表达。在胚胎发育过程中，bHLH基因的表达量较少，只有FvbHLH90/10/59/101/33/88/81/72共8个基因的表达量较高。

3 讨论

目前， 还未见关于森林草莓bHLH转录因子的

报道，本研究利用生物信息学方法鉴定得到112个森林草莓bHLH转录因子，对其理化性质进行全面分析发现，bHLH转录因子大多是不稳定的亲水蛋白，且等电点大多处于酸性范围。在拟南芥、水稻中的bHLH蛋白等电点也存在这种现象，表明bHLH转录因子的保守结构域中虽然存在basic碱性区域，但酸性氨基酸也同样富集于蛋白质分子中[27]。

在模式植物拟南芥中，研究者将133个bHLH基因划分为12个亚家族[28];水稻中的167个bHLH转录因子被分为22个亚家族[29];159个马铃薯[30]、230个大白菜[31]bHLH家族分别被划分为21、24个亚族。本研究参照拟南芥的分类方式，将森林草莓的112个bHLH转录因子分成12个亚族，其中第Ⅱ、Ⅵ亚族的成员最少，均只有1个FvbHLH基因;第Ⅲ亚族的成员最多，为19个。在拟南芥bHLH亚家族中较少的也是第Ⅱ、Ⅵ亚族，第Ⅲ亚族的bHLH成员也较多。通过染色体定位分析发现，bHLH基因在各号染色体上的分布都不均匀，并且形成了基因簇，说明它们可能属于串联复制。

已有大量研究发现，bHLH转录因子与植物的胁迫反应有关，包括抗盐、干旱、缺铁等抗胁迫过程。进化树分析发现，森林草莓FvbHLH30与拟南芥AtbHLH112[15]聚在同一分支，推测其在抗盐、耐旱和抗渗透胁迫方面也有重要作用;FvbHLH59与AtbHLH116[16]位于同一分支，因此FvbHLH59可能与植物的抗低温调控有关。bHLH家族在植物信号转导、物质合成方面也有关键作用。森林草莓FvbHLH93/57/21與拟南芥AtbHLH1/2/42[11-12]的进化关系较近，推测它们与花青素的合成有关;FvbHLH6与AtbHLH40[14]聚在同一分支，推测FvbHLH6也参与了赤霉素的合成转导。

表达模式分析结果显示，在花的发育过程中显示出高表达的部分基因主要集中于第Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ及Ⅺ、Ⅻ亚族，其中FvbHLH97/36/55/39/42/52/26/44/68/54的表达量在森林草莓花的整个发育过程中都很高，表明这些基因对于花的发育尤为重要。FvbHLH57/59/66/78/100/15/17/46几乎在果实发育的全过程表达，说明这8个基因与森林草莓果实的发育调控有关。草莓是一种重要的小型浆果，其果实主要由花托发育而来[24]。由此推测，在花托发育中起较大调控作用的FvbHLH19/21/57/9等基因可能对改善森林草莓果实的品质起着重要的作用。

本研究对森林草莓bHLH家族成员的理化性质、进化关系、染色体分布及组织表达模式等方面进行了全面分析，初步分析了bHLH基因在森林草莓花和果实发育过程中的作用，可为提高其经济价值提供理论基础和研究方向，并为进一步了解森林草莓bHLH转录因子结构与功能之间的关系和在植物生长发育过程中的调控机制提供重要的依据。

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