李雪艳 白一光 胡新颖 王伟东 周俐宏 杨迎东

摘要：OT百合品种Conca d’Or在生产中应用广泛，但病毒病危害严重，组织培养技术是获得无病毒种球的主要方式，因此亟需建立Conca d’Or无病毒原原种直接再生体系。以Conca d’Or种球为试材，应用RT-PCR技术检测获得无CMV、LSV、LMoV病毒的种球，剥取其中外层鳞片通过组培获得无菌试管苗，以无菌苗鳞片为次级外植体，研究不同植物生长调节剂对试管内小鳞茎直接再生的影响。无病毒小鳞茎试管内直接再生最适培养基为MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L KT，诱导率与诱导系数分别为100.00%、5.81;小鳞茎膨大最佳培养基为MS+90 g/L蔗糖;生根最优培养基为MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA，移栽成活率可达100.00%。本研究建立了观赏百合Conca d’Or无病毒原原种试管鳞茎高效直接再生体系。

关键词：百合;无病毒原原种;试管小鳞茎;直接再生;培养基

中图分类号： S682.2+65.04+3  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2022）02-0037-05

收稿日期：2021-04-29

基金项目：辽宁省自然科学基金（编号：2019-MS-193、2019-ZD-0379）;辽宁省重点研发项目（编号：2020JH2/10200016）;辽宁省科技特派团项目（编号：2020JH5/10100010）。

作者简介：李雪艳（1986—），女，山东烟台人，博士，助理研究员，主要从事百合栽培与育种研究。E-mail：lixueyan321@163.com。

通信作者：杨迎东，硕士，研究员，主要从事百合栽培与育种研究。E-mail：yangyingdong2011@163.com。

百合极具观赏价值、经济价值与食药用价值，在发展特色农业经济、实现乡村振兴中具有重要作用。OT百合杂种系品种Conca d’Or，植株高挺、花朵硕大、色泽娇黄、香味浓郁，拥有很高的市场认可度，是近年来切花市场主流的百合品种之一。现阶段我国生产用Conca d’Or种球全部来自国外进口，价格昂贵、质量不稳定、带病毒率高，严重制约百合产业发展。此外，目前国内普遍缺乏无病毒百合种球资源，国内流行的百合品种，种球病毒感染率高达80%以上[1]，造成百合茎、叶片和花的畸形或斑驳、植株矮小、丛簇、退化甚至死亡[2-3]。组织培养繁殖速度快、繁殖系数大、繁殖后代整齐一致、可获得无病毒苗，是主要的百合无性繁殖方式。因此获得Conca d’Or无病毒原原种对百合产业发展具有重要意义。

百合离体再生途径有器官直接发生途径、器官间接发生途径、胚状体发生途径等[4]，器官直接再生具有无污染、繁育周期短、小鳞茎无畸形的优点，是百合工厂化生产的主要技术手段。目前以Conca d’Or的鳞片、子房为材料，已诱导得到愈伤组织、不定芽、小鳞茎等[5-7]。但现有组培体系诱导周期长、诱导率偏低且未进行病毒检测，扩繁得到的后代不能保证为无毒原原种，制约其工厂化应用。目前尚无以无病毒Conca d’Or百合种球试管再生的研究报道，本研究旨在建立Conca d’Or无病毒鳞茎试管内高效直接再生体系，从而提高诱导率，缩短培养周期，快速获得大量Conca d’Or无病毒原原种，提升我国切花产业质量。本研究以经RT-PCR检测无黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、百合无症病毒（lily symptomless virus，LSV）、百合斑驳病毒（lily mottle virus，LMoV）的Conca d’Or种球中外层鳞片为初级外植体，以无菌试管苗的鳞片为次级外植体，研究不同种类与浓度植物生长调节剂对Conca d’Or小鳞茎直接再生的影响，筛选出百合Conca d’Or种球在外植体接种、增殖、生根等阶段的最佳培养基配方，建立高效Conca d’Or无病毒小鳞茎试管内直接再生体系，为百合种球工厂化繁育提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2019年10月在辽宁省农业科学院花卉研究所组织培养室进行。OT百合Conca d’Or组培无菌苗，小鳞茎周径大于1 cm，外植体接种原始材料为荷兰进口种球，鳞茎周径14～16 cm。

苄基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、激动素（KT）、蔗糖、琼脂，均为分析纯，购自北京康贝斯生物科技有限公司;多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、DNA Marker，购自天根生化科技（北京）有限公司;cDNA反转录试剂盒，购自Promega公司;琼脂糖，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基准备

试验采用MS固体培养基（含MS基本培养基，蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L，pH值为5.8），根据小鳞茎发生、膨大、生根3个发育阶段设计不同的植物生长调节剂配方试验，于121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2.2 无病毒原始试验材料准备

提取鳞片RNA，RNA质量和浓度检测合格后用于后续cDNA合成。根据CMV、LSV、LMoV已公布的序列设计PCR扩增引物，PCR体系采用Ex Taq PCR System（TaKaRa），产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测无病毒的种球用于培养无菌苗。

1.2.3 小鳞茎诱导试验

取无菌苗的鳞片，沿四周边缘切去0.2 cm，然后沿鳞片基部横向切成0.2～0.3 cm的小块，接种至不同配方培养基，切面接触培养基，每瓶接种3～6片，每个处理10瓶，于（25±1） ℃的培养室中暗培養。接种45 d后调查统计诱导率及诱导系数。

1.2.4 小鳞茎膨大试验

将大小一致的小鳞茎转入添加30、60、90、120、150 g/L蔗糖的培养基中，45 d 后调查小鳞茎的周径。

1.2.5 小鳞茎生根试验

将直径1 cm的小鳞茎接种于添加不同浓度NAA（0.1、0.2、0.5 mg/L）、IBA（0.01、0.10 mg/L）的培养基中，45 d后调查根长、生根率及根数。

1.2.6 练苗移栽

将生根后的组培苗移至冷库，4 ℃ 低温处理3个月后将小鳞茎从瓶中取出，洗去根部附着的琼脂，随后消毒30 min，最后栽植于草炭和蛭石混合基质（体积比为1 ∶1）中，于日光温室中培养。定植后30 d，统计小苗移栽成活率。

1.3 数据统计及分析方法

小鳞茎诱导率=产生小鳞茎的外植体数/接种的外植体总数×100%;

小鳞茎诱导系数=产生的小鳞茎数量/产生小鳞茎的外植体总数;

生根率=生根苗数/接种苗数×100%。

试验设3次生物学重复，定期观测并调查数据。各处理之间差异显著性用DPS 7.05软件分析，统计方法采用邓肯新复极差法。

2 结果与分析

2.1 无CMV、LSV、LMoV病毒的Conca d’Or种球的获得

如图1所示，种球1和8中检测到CMV病毒，种球2和7检测到LMoV病毒，种球4和6检测到LSV病毒，种球5既检测到LSV病毒又检测LMoV病毒，种球3和9没有检测到CMV、LSV、LMoV病毒，可用于后续试验。

2.2 不同浓度6-BA、NAA对无菌苗鳞片直接再生小鳞茎的影响

由表1可知，6-BA与NAA可促使Conca d’Or百合无菌苗鳞片诱导分化，各处理诱导系数均可达到3.1以上。随着6-BA与NAA浓度的增加，小鳞茎诱导系数先增加后降低，其中处理2即MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA的诱导系数最高。然而，各处理间的小鳞茎诱导率与诱导系数均无显著差异。此外，试验中发现培养基中同时添加6-BA与NAA，会导致诱导的小鳞茎出现畸形，即鳞片呈莲座状簇拥（图2-A），而莲座化的小鳞茎在后续增殖与膨大培养中仍会表现为畸形，不适于百合种球的工厂化生产。因此，6-BA与NAA不利于Conca d’Or百合小鳞茎的直接再生。

2.3 不同浓度2，4-D对无菌苗鳞片直接再生小鳞茎的影响

将Conca d’Or百合无菌苗鳞片接种到添加了不同浓度2，4-D的培养基中，结果发现鳞片基部可直接诱导分化得到小鳞茎，且小鳞茎形状周正无畸形（图2-B），表明2，4-D适于Conca d’Or百合无菌苗鳞片直接诱导分化小鳞茎。由表2可知，不同浓度2，4-D的小鳞茎诱导率都可达到100.00%，且诱导效果要好于6-BA和NAA。此外，发现较高浓度的2，4-D有利于Conca d’Or小鳞茎的诱导，当2，4-D浓度在1.0～2.5 mg/L时，小鳞茎诱导系数无显著差异，均在4.4以上，其中以1.5 mg/L 2，4-D诱导效果最佳。

2.4 不同浓度2，4-D、KT对无菌苗鳞片直接再生小鳞茎的影响

由表3可知，與仅添加2，4-D相比，培养基中同时添加2，4-D与KT更有利于Conca d’Or百合试管内小鳞茎的直接再生，其小鳞茎诱导系数要高于单独添加2，4-D，这说明生长素与细胞分裂素配比更有利于Conca d’Or小鳞茎的直接诱导再生。此外，不同浓度2，4-D与KT组合，小鳞茎的诱导率基本可达到100.00%。而当2，4-D为2.0 mg/L、KT为0.05 mg/L时，小鳞茎的诱导系数最高，可达到5.81，最适于Conca d’Or小鳞茎的试管内直接再生（图2-C）。

2.5 不同浓度NAA、KT对无菌苗鳞片直接再生小鳞茎的影响

添加不同浓度NAA、KT可促进无菌苗鳞片直接再生小鳞茎。由表4可知，不同浓度NAA与KT处理对Conca d’Or鳞片再生小鳞茎诱导率影响差异不大，均可达到97.00%以上。与同为细胞分裂素的6-BA不同，KT与NAA配比可诱导出球形周正的小鳞茎，不会产生无莲座化现象（图2-D）。当MS培养基中添加0.10 mg/L NAA与0.10 mg/L KT时，试管内小鳞茎诱导系数可达到3.83。

2.6 不同浓度蔗糖对小鳞茎膨大的影响

在MS培养基中添加蔗糖可以使小鳞茎体积增大，但增大的幅度随着培养基中蔗糖浓度的升高有显著不同（图3）。其中90～120 g/L蔗糖对小鳞茎增大幅度无显著性差异，而培养基中添加90 g/L蔗糖可使小鳞茎达到最大周径4.35 cm，同时小鳞茎生根效果也较好。

2.7 不同浓度IBA、NAA对生根的影响

从表5可以看出，添加不同浓度NAA与IBA时Conca d’Or鳞茎生根率都能达到100.00%，但是生根效果不同，根长和生根数方面均有差异。对于根长来说，单独添加NAA效果要优于单独添加IBA，以处理3效果最好;对于生根数来说，单独添加IBA的效果要优于单独添加NAA。综上可知，MS+0.1 mg/L NAA+0.10 mg/L IBA最适合Conca d’Or小鳞茎诱导生根，且生根情况适合移栽（图2-E）。

2.8 炼苗移栽

经炼苗后的组培苗移栽至消毒完全的基质中，成活率均达到100%，并且长势健壮（图2-F）。

3 讨论与结论

百合多采用无性繁殖种球，易造成病毒不断累积，使品种严重退化，失去观赏价值[8]，因此培育无病毒种球已成为百合生产的关键环节。利用化学药剂或生物制剂难以对病毒病进行有效防治， 而目前病毒脱除是获得百合无病毒植株的主要途径[9]。随着科学技术的迅猛发展，目前检测、鉴定病毒的方法主要有生物学检测法、电子显微镜检测法、免疫学检测法以及分子生物学检测法[10-12]。无病毒百合获得一般是通过茎尖脱毒[13]、热处理[14]、超低温[15]等。但目前脱毒方法存在技术要求高、操作复杂、脱毒率低等缺点，本研究通过PCR检测获得无病毒百合种球，以此为原始材料进行无病毒种球试管内直接快繁，周期短、效率高、操作简单，可以快速获得大量优质百合脱毒种苗。

迄今为止，百合试管内再生已开展了较多研究[15-20]，目前关于Conca d’Or百合组织培养的研究相对较少，主要以不定芽诱导和愈伤组织诱导为主，相关研究结论不尽相同。其中潘正波等以Conca d’Or的子房为材料，发现MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 适于愈伤组织的诱导[5];张悦等则认为，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA有利于Conca d’Or鳞片诱导不定芽[6];而蔡宣梅等研究发现，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L 2，4-D可促进鳞片再生试管小鳞茎[7]。本试验则发现，2.0 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L KT最适于小鳞茎直接形成，这可能与添加的外源激素的种类和浓度配比以及取材时间与接种方式有关。有研究认为50～70 g/L蔗糖最利于Conca d’Or小鳞茎膨大培养[7]，而本研究发现60～150 g/L蔗糖对小鳞茎膨大均有较好的促进效果，但以90 g/L浓度蔗糖效果最佳。

综上所述，本研究以Conca d’Or无菌苗鳞片为研究对象，建立了无病毒试管小鳞茎直接再生体系，筛选出小鳞茎直接再生最适培养基为MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.05 mg/L KT，小鳞茎膨大最适培养基为MS+90 g/L蔗糖，生根最适培养基为 MS+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA。

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